酶工程酶的分離純化

關(guān)于酶工程酶的分離純化第1頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶分離純化的目的

酶分離純化的目的是使酶制劑產(chǎn)品達(dá)到應(yīng)用所需的純度。第2頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六分離純化過(guò)程包括3個(gè)基本步驟：

1抽提

2純化

3制劑第3頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六Crudeproductconcentrationversussellingprice(Dwyer,1984)第4頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六某些生化物質(zhì)在原料液中的

濃度與價(jià)格的關(guān)系(1984年)

物質(zhì)名濃度(C)價(jià)格(P，＄)尿激酶510－53108熒光素酶810－32106胰島素410－19104頭孢菌素10102乙醇1102310－1第5頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六在分離純化中必須注意：

1防止酶的變性失活；

2在分離純化過(guò)程中的每一步都

應(yīng)檢測(cè)酶的活性，以確定酶的

純化程度和回收率。第6頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第一節(jié)酶活力的測(cè)定幾個(gè)名詞

1酶活力或酶活性 2酶活力單位 3mol催化活性（分子活性）和轉(zhuǎn)換 數(shù)（催化中心活力) 4酶的比活力第7頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶活力（又稱酶活性）

(enzymeactivity)（IU/g或IU/mL)

指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力；用在一定條件下，所催化的反應(yīng)初速度來(lái)表示；是研究酶的特性，酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用以及分離純化時(shí)的一項(xiàng)必不可少的指標(biāo)。第8頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶活力單位(enzymeactivityunit)

表示酶活力大小的尺度；

一個(gè)國(guó)際單位（IU）是指在特定條件下（25

0C），每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物或催化形成1mol產(chǎn)物所需的酶量

一個(gè)Kat是指每秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量，1Kat=6107IU。第9頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六mol催化活性（分子活性）和

轉(zhuǎn)換數(shù)（催化中心活力）

mol催化活性是指單位時(shí)間內(nèi)，每個(gè)酶分子所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目；轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat)是指酶分子中每個(gè)活性中心所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目。如果酶分子中只有一個(gè)活性中心，那么mol催化活性與轉(zhuǎn)換數(shù)相等，如果酶分子中含有n個(gè)活性中心，那么轉(zhuǎn)換數(shù)則為mol催化活性除以n。第10頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶的比活力

（specificactivity)

酶的比活力是酶純度的量度，是指單位重量酶蛋白所具有的酶活力，單位為IU/mg。比活力越大，酶純度越高。第11頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶活力的測(cè)定方法：１終止反應(yīng)法２和連續(xù)反應(yīng)法。第12頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六終止反應(yīng)法

在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中，每隔一定時(shí)間，取出一定體積的反應(yīng)液，用強(qiáng)酸強(qiáng)堿或SDS以及加熱等使反應(yīng)立即停止，然后用化學(xué)法、放射性化學(xué)法或酶偶聯(lián)法分析產(chǎn)物的形成量或底物的消耗量。這是最經(jīng)典的酶活力測(cè)定方法，幾乎所有的酶都可以根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)出具體的測(cè)定方法。第13頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六連續(xù)反應(yīng)法

無(wú)須終止反應(yīng)，而是在酶反應(yīng)過(guò)程中用光化學(xué)儀器或電化學(xué)儀器等來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行情況，對(duì)記錄結(jié)果進(jìn)行分析，然后計(jì)算出酶活力。第14頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶不可逆失活的原因和機(jī)理第15頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六蛋白質(zhì)（酶）的失活機(jī)理第16頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六蛋白質(zhì)不可逆失活的原因蛋白酶水解或自溶作用表面活性劑和去垢劑聚合作用氧化作用機(jī)械力變性劑重金屬離子和巰基試劑冷凍和脫水熱極端pH蛋白質(zhì)不可逆失活脲和胍高濃度鹽螯合有機(jī)溶劑輻射作用第17頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化第18頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六蛋白質(zhì)穩(wěn)定化蛋白質(zhì)穩(wěn)定化途徑如何防止蛋白質(zhì)的可逆伸展如何防止蛋白質(zhì)不可逆失活反應(yīng)發(fā)生第19頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六穩(wěn)定蛋白質(zhì)（酶）的方法第20頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶分離的一般流程

原料液細(xì)胞分離(離心，過(guò)濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過(guò)濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過(guò)濾、超過(guò)濾)濃縮(超過(guò)濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性第21頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第二節(jié)酶溶液的制備第22頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶溶液的制備：

把酶從生物原料中抽提出來(lái)，作成酶溶液

酶溶液的制備包括：材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎、抽提、凈化脫色、抽體液的濃縮等幾個(gè)步驟。

第23頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六一、材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎

材料預(yù)處理：酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的分布有三種情況：胞外酶，胞內(nèi)酶（溶酶和晶酶）。第24頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六微生物胞外酶

可以用鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀成酶泥

胞內(nèi)酶

要先收集菌體，經(jīng)細(xì)胞破碎后提取第25頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六動(dòng)物材料

應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織等

植物材料

應(yīng)去皮等以免單寧等物質(zhì)著色污染第26頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞破碎：

物理和化學(xué)兩大類方法第27頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1、物理破碎：

—研磨（手磨，球磨和石磨），

—機(jī)械搗碎（勻漿器和高速組織搗碎器等），

—高壓法，

—爆破性減壓法，

—專用波振蕩，

—快速冷凍融化法等。第28頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、化學(xué)破碎：

—滲透作用

—自溶：

—酶處理

—表面活性劑第29頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（I）滲透作用

將指數(shù)生長(zhǎng)期的菌體用緩沖液洗凈，并懸浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris緩沖液中，離心，加入MgCl2劇烈攪拌，可使一些水解酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。

第30頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（II）自溶

向菌體中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使細(xì)胞滲透性改變保持一定時(shí)間后可以使細(xì)胞自溶；第31頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（III）酶處理

用溶菌酶專一性地分解原核微生物細(xì)胞壁，使胞內(nèi)酶釋放第32頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（IV）表面活性劑

膜結(jié)合的晶酶在細(xì)胞破碎后很難溶解，常借助于表面活性劑與脂蛋白形成微泡，使之溶解。第33頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、抽提—大多數(shù)酶蛋白是屬于球蛋白，因此，可用稀鹽、稀堿或稀酸的水溶液進(jìn)行抽提；—抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其它物質(zhì)的連結(jié)。第34頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1、提取的主要方法：

（1）鹽溶液提取

（2）酸溶液提取

（3）堿溶液提取

（4）有機(jī)溶劑提取

第35頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、酶提取過(guò)程的注意事項(xiàng)

——pH的選擇

——鹽的選擇

——溫度的選擇

——抽提液用量

——其它

第36頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六pH的選擇

——首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng)

遠(yuǎn)離等電點(diǎn)；一般選擇pH4-6

為宜。第37頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六鹽的選擇

——大多數(shù)酶在低濃度的鹽溶液

中有較大的溶解度，一般選

擇等滲鹽溶液，如0.02-0.05

mol/L的磷酸緩沖液或0.15

mol/L的NaCl等。第38頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六溫度的選擇

——一般控制在0-40C，如果酶

比較穩(wěn)定可以例外。第39頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六抽提液用量

——常采用材料量的1-5倍第40頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六其它

——加入蛋白酶抑制劑、半胱

氨酸或細(xì)胞色素C等，來(lái)

穩(wěn)定抽提系統(tǒng)。第41頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、酶溶液的絮凝、凈化與脫色第42頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六絮凝

——由于發(fā)酵液黏度較大，細(xì)胞表面電荷排

斥以及多糖蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成的

水化層等給酶溶液的離心或過(guò)濾帶來(lái)困

難；因此要用絮凝劑進(jìn)行處理。

——絮凝劑：多種類型

無(wú)機(jī)：如醋酸鈣和磷酸鈣等

有機(jī)：如聚丙烯酰胺等

天然高分子：如殼多糖等第43頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六過(guò)濾或離心凈化

——通過(guò)絮凝劑處理后的酶溶液經(jīng)過(guò)離心或過(guò)濾將細(xì)胞碎片等固性物和雜蛋白，粘多糖，核酸以及脂類等大分子物質(zhì)去除。第44頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六脫色

——酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過(guò)吸附色素而脫色；活性炭用量一般為0.1%-1.5%。第45頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六四、酶溶液的濃縮

—冷凍干燥法

—蒸發(fā)法：

—超過(guò)濾法：

—膠過(guò)濾法：

—干燥第46頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六冷凍干燥法

——先將酶溶液凍成固體，然后在真空狀態(tài)下使水分子從固體表面直接升華。第47頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六蒸發(fā)法

——目前工業(yè)上采用較多的是薄膜蒸發(fā)法，在高度真空狀態(tài)下使酶溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闃O薄的液膜，通過(guò)加熱而迅速汽化，經(jīng)旋風(fēng)式汽液分離器達(dá)到濃縮的目的。第48頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六超過(guò)濾法

——將酶溶液通過(guò)只允許小分子物質(zhì)通過(guò)的微孔濾膜，大分子的酶蛋白被截留而達(dá)到濃縮的目的。第49頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六膠過(guò)濾法

——利用SephadexG-250或G-50吸水膨脹，而酶蛋白被排阻在膠的外面。第50頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六其它方法

——吸水劑如用聚乙二醇(PEG)處理小量樣品。第51頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六干燥

——將固體、半固體或濃縮液中水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水量較少的固體過(guò)程。

——方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥第52頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第三節(jié)酶分離純化的基本過(guò)程第53頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六一、酶分離純化方法的選擇

目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異而建立的，在選擇分離純化方法時(shí)，要考慮以下幾個(gè)方面：—首先對(duì)待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解；—以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是否得當(dāng)；—嚴(yán)格控制操作條件，防止酶的變性失活。第54頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六選擇生物分離方法的依據(jù)

1物理化學(xué)性質(zhì)

2生物體系的特性

3能用作分離和純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)第55頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

1.物理化學(xué)性質(zhì)分子大小、分子量、分子體積、極性、偶極矩、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、汽化熱、離子電荷、溶解度參數(shù)、折射率、表面張力、介電常數(shù)、密度、粘度、酸堿強(qiáng)度、pK值、等電點(diǎn)(pI)等等。物質(zhì)之間得以分離的主要依據(jù)就是組分間的物化性質(zhì)的差異。在涉及具有生物活性物質(zhì)的體系中，有關(guān)這方面的數(shù)據(jù)與化工產(chǎn)品相比要少得多，嚴(yán)重影響了生物分離過(guò)程的有效進(jìn)行。因此，生物體系的物化性質(zhì)的研究應(yīng)成為一個(gè)重點(diǎn)。第56頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2.生物體系的特性對(duì)一些有生物活性的物質(zhì)，不是能夠用一般的物化性質(zhì)來(lái)表達(dá)的，這就需要了解這些物質(zhì)的生物特性，特別要知道影響生物特性變化的條件和這些物質(zhì)失活的因素，包括溶劑、pH值、溫度等等。這種保持生物質(zhì)特性不至于改變的措施就是所謂的穩(wěn)定性維持。第57頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3.能用作分離和純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)能從混合物中分離和純化出一種蛋白質(zhì)是因?yàn)椴煌鞍踪|(zhì)有著不同的物理和化學(xué)性質(zhì)。這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目和序列不同造成的。連接在多肽主鏈上的氨基酸殘基可以是帶正電荷的或帶負(fù)電荷的、極性的或非極性的、親水性的或疏水性的。此外，多肽可折疊成非常確定的二級(jí)結(jié)構(gòu)(螺旋、折疊和各種轉(zhuǎn)角)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，形成獨(dú)特的大小、形狀和殘基在蛋白質(zhì)表面的分布狀況。利用待分離蛋白質(zhì)與混合物中其它蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)上的差異，即能設(shè)計(jì)出一組合理的分級(jí)分離步驟。第58頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶分離純化方法

—根據(jù)分子大小建立的分離純化方法

—根據(jù)溶解度建立的分離純化方法

—根據(jù)電荷性質(zhì)建立的分離純化方法

—根據(jù)親和作用建立的分離純化方法

—根據(jù)穩(wěn)定性差異建立的分離純化方法

．．．．．．第59頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六一、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法

——透析

——超過(guò)濾

——離心

——凝膠過(guò)濾等。第60頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1、透析(Dialysis)法：

過(guò)程：將酶溶液裝入透析袋中，放入蒸餾水或稀緩沖液中，小分子物質(zhì)通過(guò)透析袋進(jìn)入水或緩沖液中，而蛋白質(zhì)被截留在透析袋中；

透析袋類型：有兩種，再生纖維素膜透析袋和纖維素酯透析袋。有多種型號(hào)和規(guī)格，主要參數(shù)是分子量截留值（1102D）；商品名為spectrapor等。

透析袋的預(yù)處理：干燥的透析袋在制備過(guò)程中曾用10%甘油處理過(guò)，只要浸泡濕潤(rùn)和蒸餾水洗滌即可使用；必要時(shí)可用10mmol/L碳酸氫鈉，50%乙醇和10mmol/LEDTA處理后，再用蒸餾水洗滌。第61頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六透析袋酶溶液蒸餾水第62頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六透析裝置和過(guò)程第63頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、超過(guò)濾

利用壓力或離心力強(qiáng)行使溶質(zhì)按大小形狀的差異分開(kāi)，將所需的酶分子被濾膜截留，而其它較小的分子隨溶劑被壓到膜的另一側(cè)。第64頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六超濾膜——制備超濾膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜類，聚四氟乙烯等；目前有圓形和卷式等多種超濾膜類型；主要參數(shù)是截留分子量，耐受壓力和濾速和有效過(guò)濾面積等；主要商品型號(hào)有AmiconDiaflo系列等。

超濾器類型——有管式，中空纖維式，螺旋卷繞式和平板式四種類型。第65頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液超濾裝置第66頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、離心法

——離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分開(kāi)的技術(shù)。第67頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

（1）離心機(jī)的種類和用途

（2）沉降系數(shù)S

（3）離心方法的選擇

差速離心

密度梯度離心

等密度離心

（4）離心條件的確定

離心力

離心時(shí)間

離心溫度和pH值第68頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六梯度離心密度梯度在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大,向上逐漸減小蔗糖便宜，純度高，濃溶液（60％，w/w）密度可達(dá)1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷合成的高聚物，Mr約400000。需要高密度和低滲透壓的梯度時(shí)，可用Ficoll代替蔗糖。第69頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4、凝膠過(guò)濾法

原理：又稱分子篩層析，在層析柱中填充凝膠介質(zhì)，加入待分離的酶溶液，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，樣品自上而下擴(kuò)展，大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入膠粒內(nèi)部而從膠粒間空隙擴(kuò)展，下移速度較快，而小于凝膠孔徑的分子進(jìn)入膠粒內(nèi)部，下移速度較慢，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后不同大小分子按先大后小的順序從層析柱中流出。第70頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六凝膠過(guò)濾第71頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六凝膠過(guò)濾第72頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六TubesmarchinfromleftA280Fraction#第73頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六部分使用的擔(dān)體目前使用最廣泛的擔(dān)體材料：

※交聯(lián)后的葡聚糖凝膠

※聚丙烯酰胺

※瓊脂

※其它物料第74頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、根據(jù)溶解度建立的分離方法

1、鹽析(SaltingOut)法

2、降低介電常數(shù)法（有機(jī)溶劑沉淀

法）

3、等電點(diǎn)沉淀法

4、共沉淀法

5、選擇性沉淀法：第75頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1、鹽析法

最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為100%。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時(shí)）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時(shí)）。

加入飽和硫酸銨：100ml溶液中，由飽和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的ml數(shù)V=V0（S1-S2）/（1-S2）。

直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表”。第76頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、降低介電常數(shù)法

（有機(jī)溶劑沉淀法）

降低介電常數(shù)方法在酶溶液中加入與水互溶的有機(jī)溶劑，可以降低介電常數(shù)，使酶分子間的靜電引力增加而發(fā)生沉淀。第77頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響介電常數(shù)的主要因素：

——溫度

——有機(jī)溶劑

——離子強(qiáng)度

——pH值：第78頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六溫度：

——在0℃下進(jìn)行操作；有機(jī)溶劑必須冷至-15~-20℃，邊攪拌邊緩慢加入，沉淀析出后迅速離心分離，并用預(yù)冷緩沖液溶解沉淀。第79頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

有機(jī)溶劑：

——常用的有機(jī)溶劑有丙酮，乙醇，甲醇，異丙醇等第80頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六離子強(qiáng)度

——大多數(shù)中性鹽在低濃度時(shí)能增加酶蛋白的溶解并減少變性，在有機(jī)溶劑沉淀中加入5~10%（<0.05mol）的硫酸銨有助于提高分辨率。第81頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

pH值

——盡可能接近酶的等電點(diǎn)pI第82頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、等電點(diǎn)沉淀法

——酶在等電點(diǎn)處容易發(fā)生沉淀

第83頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4、共沉淀法

——一些大分子非離子型聚合物如聚乙二醇（PEG）,聚乙烯亞胺（PEI）單寧酸，硫酸鏈霉素以及表面活性劑（SDS）等在一定條件下可以直接或間接與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀析出,再用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑溉芙獬鰜?lái)。第84頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六5、選擇性沉淀法：有些多聚電解質(zhì)可以在極低濃度下選擇性地與某些酶結(jié)合而形成沉淀。如聚丙烯酸（PAA）可以與某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分離過(guò)程如下：

PAA+酶酶

PAA-酶+Ca2+PAA-Ca2++酶

PAA-Ca2++SO4

2-CaSO4+PAA第85頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、按蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)設(shè)計(jì)的分離方法

1、吸附法

（1）物理吸附法

（2）羥基磷灰石法

（3）離子交換吸附法-離子交換色譜法

2、電泳法

（1）區(qū)帶電泳

（2）等點(diǎn)聚焦電泳

（3）高效毛細(xì)管電泳

（4）聚焦層析第86頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（1）物理吸附法(不介紹)第87頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（2）羥基磷灰石法——羥基磷灰石是一種微晶型磷酸鈣；一般認(rèn)為其表面的鈣離子和磷酸根離子與蛋白質(zhì)帶相反電荷的基團(tuán)發(fā)生相互作用；在低鹽和弱酸或中性條件下進(jìn)行吸附；洗脫時(shí)提高離子強(qiáng)度；多采用柱層析方式進(jìn)行。第88頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

（3）離子交換吸附法

——離子交換色譜法

——利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來(lái)。

第89頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六離子交換層析過(guò)程：

—離子交換劑的預(yù)處理

—平衡

—裝柱

—加樣吸附

—洗脫

—洗脫液收集與相應(yīng)檢測(cè)

—離子交換劑的再生第90頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六離子交換劑

——一般由高分子支持介質(zhì)（母體）和功能基團(tuán)（離子交換基）兩部分組成。第91頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六離子交換劑應(yīng)滿足下列要求：（1）有高度的不溶性，即在各種溶劑中進(jìn)行交換時(shí)，交換劑不發(fā)生溶解（2）有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換（3）有較多的交換基團(tuán)（4）有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，在使用過(guò)程中，交換劑不能因物理或化學(xué)因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。第92頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六離子交換劑的3種類型

——根據(jù)高分子支持介質(zhì)的性質(zhì)

——離子交換樹(shù)脂

——離子交換纖維素

——離子交換球型多糖(如葡聚糖凝膠

和瓊脂糖凝膠等)。第93頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2、電泳法

——在直流電場(chǎng)中，由于各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，移動(dòng)速度不同，形成各自的區(qū)帶，用顯色劑如CoomassieBlue染色后，可以在支持物上看到蛋白質(zhì)的顏色譜帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)。第94頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六基本原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定pH下，可解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)作用下可以向與其電荷相反的方向的電極泳動(dòng)，泳動(dòng)速度主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及顆粒的大小和形狀。第95頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六由于各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）不同，分子量不同，在同一個(gè)pH緩沖溶液中所帶電荷不同，故在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度也不同，利用此性質(zhì)，可將混合物中不同蛋白質(zhì)分離開(kāi)，也可用其對(duì)樣品的純度進(jìn)行鑒定。第96頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六雙向電泳-1第97頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六雙向電泳-2第98頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六雙向電泳-3第99頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳法

（1）區(qū)帶電泳

（2）等點(diǎn)聚焦電泳

（3）高效毛細(xì)管電泳

第100頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（1）區(qū)帶電泳

——在惰性支持物上進(jìn)行電泳時(shí)樣品中各組分遷移速度不同而分布成區(qū)帶的一類電泳分離方法

——按支持物的物理性狀可分為3種類型：

—膜電泳

—粉末電泳

—凝膠電泳第101頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六膜電泳

——以濾紙、聚酰胺薄膜，醋酸纖維薄膜等為支持物的一類電泳分離方法。第102頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六粉末電泳

——以淀粉、纖維素粉或硅膠粉等為支持物的分離方法。第103頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六凝膠電泳

——以聚丙烯酰胺為支持物，兼有分子篩效應(yīng)。

第104頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六區(qū)帶電泳的優(yōu)點(diǎn)分辨率較好設(shè)備簡(jiǎn)單操作方便第105頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（2）等點(diǎn)聚焦電泳

——利用兩性電解質(zhì)在直流電場(chǎng)中形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度，樣品中各種蛋白質(zhì)在各自的等電點(diǎn)在相應(yīng)的pH區(qū)段聚集而達(dá)到分離的目的。第106頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六等電聚焦電泳第107頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳是在內(nèi)徑為25~100m的石英毛細(xì)管中進(jìn)行電泳，毛細(xì)管中填充了緩沖液或凝膠。使用毛細(xì)管的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是:它減少了由于熱效應(yīng)產(chǎn)生的許多問(wèn)題，因?yàn)楣艿目讖叫?，面積與體積之比大，這樣可以提高熱散失，有助于消除由于熱引起的擴(kuò)散增加而造成的對(duì)流和區(qū)帶變寬，因此管中不需要加入穩(wěn)定介質(zhì)即可進(jìn)行自由流動(dòng)電泳。第108頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六第109頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺作為支持物的一種電泳方法。PAGE方法成了研究蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的重要工具之一.第110頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)踐中可根據(jù)不同目的選擇所需的類型。一般單向PAGE多用于分離具有活性的生物物質(zhì)，而雙向或梯度PAGE則宜用于較難分離鑒別的生物大分子物質(zhì)。如果在PAGE時(shí)加入適量十二烷基磺酸鈉（SDS）可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量；如果PAGE與等電聚焦相結(jié)合時(shí)，可用于分析蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。除這些用途外，PAGE還可用于制備少量的純度高、有活性的生物大分子物質(zhì)第111頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，電泳顆粒通過(guò)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙時(shí)受到摩擦力的作用，摩擦力的大小與樣品顆粒的大小呈正相關(guān)?；驹砭郾０纺z丙烯酰胺（acrylamideAcr）單體（monomer）N，N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene-bisacrylamide，Bis）交聯(lián)劑（crosslinker）聚合交聯(lián)第112頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六原理：當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，SDS能破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械臉?gòu)象，特別是強(qiáng)還原劑硫基乙醇的存在，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵還原，從而保證蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳第113頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于如果加入一種試劑消除電荷、形狀等因素的影響，使電泳遷移率只取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。凈電荷分子的大小形狀等因素第114頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（SDS）的主要用途是蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)混合組分的分離蛋白質(zhì)亞基組分的分析等第115頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六四、根據(jù)親和作用建立的純化方法第116頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六根據(jù)親和作用建立的純化方法

——由于酶對(duì)底物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,輔酶等配體具有較高的親和力，而其它雜蛋白對(duì)這些配體則沒(méi)有或有很弱的親和作用，因此，可以根據(jù)酶與雜蛋白對(duì)配體親和力的差異，很容易地將酶分離出來(lái)。

——目前已經(jīng)建立的方法有親和層析法和親和電泳法等。

第117頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1、親和層析法

——親和層析的核心是親和吸附劑，它是由固相載體和能與目的酶專一可逆結(jié)合的配體共價(jià)結(jié)合而成的。將親和吸附劑填充層析柱，讓酶液流過(guò)層析柱，則目的酶就能迅速而選擇性地吸附在親和吸附劑上，用適當(dāng)?shù)娜芤哼M(jìn)行洗滌，除去一些非專一性的雜蛋白后，再用濃度高的或親和力更強(qiáng)的配體溶液進(jìn)行親和洗脫目的酶便可被洗脫出來(lái)。第118頁(yè)，共132頁(yè)，2023年，2月20日，星期六親和層析中的配體構(gòu)成示意圖

Matrix:forligandattachment,shouldbechemicallyandphysicallyinert.

Spacerarm:improvebindingbetweenligandandtargetmoleculebyovercominganyeffectsofsterichindrance.Ligand:moleculethatbindsreversiblyt