造血干細(xì)胞移植

關(guān)于造血干細(xì)胞移植第1頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六造血干細(xì)胞移植(SCT)按其干細(xì)胞的來源,分為：

（1）自體造血干細(xì)胞移植(ASCT)

（2）同種異基因造血干細(xì)胞移植(Allo-SCT)

（3）異種造血干細(xì)胞移植(SCT)。第2頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六根據(jù)干細(xì)胞采集的部位又可分為：

（1）骨髓移植(BMT)

（2）外周血造血干細(xì)胞移植(PBSCT)

（3）臍血造血干細(xì)胞移植(NCSCT)

（4）胎肝造血干細(xì)胞移植(NLSCT)第3頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

骨髓移植第4頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

骨髓移植(簡稱BMT)是指對(duì)病人實(shí)施免疫抑制處理后,使機(jī)體失去排斥異體組織的能力,通過移植骨髓中的多能造血干細(xì)胞給病人,以重建造血和免疫功能,從而達(dá)到治愈某些疾病的一種方法。

第5頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六一、骨髓移植種類

根據(jù)骨髓的不同來源,可將骨髓移植分為：

自體骨髓移植(ABMT)

同種異基因骨髓移植(Allo-BMT)

同種同基因骨髓移植(SBMT)

異種骨髓移植第6頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六(一)自體骨髓移植(ABMT)

取患者自身骨髓進(jìn)行保存。

在其相應(yīng)時(shí)間內(nèi),用大劑量的放療和/或化療,最大限度地殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞,然后再輸回自體骨髓,恢復(fù)患者造血功能。

此種移植不會(huì)出現(xiàn)排斥和移植物抗宿主病(GVHD)等嚴(yán)重合并癥,骨髓移植容易植活，但極易復(fù)發(fā)。

第7頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

ABMT時(shí)必須注意以下幾個(gè)方面:

①腫瘤必須未累及骨髓,移植前骨盆未受過射線照射。

②年齡不宜過大。

③腫瘤必須對(duì)放、化療敏感。

④自體骨髓移植有利于保護(hù)骨髓,免受放、化療影響。

⑤不能防止放、化療對(duì)心、肝、腎等臟器的毒性損害。第8頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六⑥自體骨髓成功的關(guān)鍵是：

保存造血干細(xì)胞的活力和基本功能。骨髓采集后如置于常溫下,骨髓在培養(yǎng)液或保存液內(nèi)最長不能超過72小時(shí)。

因此大劑量放、化療須在短時(shí)間內(nèi)完成,或者有時(shí)難以忍受。

在-196℃長期保存。第9頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六⑦對(duì)緩解期腫瘤(尤其是血液系統(tǒng)的白血病和多發(fā)性骨髓瘤)進(jìn)行BMT,采集的骨髓最好能行體外凈化,去除殘存的腫瘤細(xì)胞,否則移植后復(fù)發(fā)率極高。

⑧移植后不出現(xiàn)GVHD,就不會(huì)出現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng),故復(fù)發(fā)率極高。

第10頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（二）同種同基因骨髓移植(SBMT)

在人類僅限于同卵雙胎間的移植,這種機(jī)會(huì)極少。因無供受者間免疫方面的障礙,無需免疫抑制處理,也不會(huì)出現(xiàn)排斥和GVHD,因而臨床效果較好。

倘若用于治療白血病、多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤,移植后復(fù)發(fā)率比Allo-BMT要高,這可能與缺乏移植物抗腫瘤效應(yīng)作用有關(guān)。

第11頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（三）同種異基因骨髓移植(Allo-BMT)

是指供一受者之間主要組織相容性復(fù)合物(簡稱MHC)相合的同種兩個(gè)個(gè)體間的移植。

目前開展的是基因型相同或基本相同的兄弟姐妹間的移植,少數(shù)為親子間的移植,也有人類白細(xì)胞抗原(簡稱HLA)表型相同的無關(guān)人員之間移植，此種移植機(jī)會(huì)極少。

易并發(fā)GVHD,但其優(yōu)點(diǎn)是移植后療效比ABMT和SBMT佳。

第12頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六二、供受者選擇:

（一）受者(患者)選擇應(yīng)注意:

(1)年齡控制2～50周歲。

(2)選擇合適的移植時(shí)機(jī),如：急淋高危組和急非淋CR1后,低危組急淋則在CR2后；慢性粒細(xì)胞性白血病在慢性期的早期(發(fā)病一年以內(nèi))，而重型再生障礙性貧血應(yīng)盡早移植。第13頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六(3)無急慢性感染病灶。

(4)左心室射血指數(shù)＞5.0、用力肺活量(forcedvitalcapatity)≥60%、一氧化碳彌散能力(DLCO)≥50%。

(5)血肌酐＜110μmol/L(2mg/dl)和總膽紅素＜18μmol/L(＜2mg/dl）。

第14頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（二）供者選擇:

首選HLA配型相合的同胞兄弟姐妹為供者,如有兩個(gè)以上供者應(yīng)選擇與患者ABO血型或性別相同者。

也可選擇單倍型相同的家庭成員作為供者。第15頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

選用HLA表型相同或相似的無關(guān)人員作供者,由于HLA的高度多態(tài)性,使其概率甚小。

第16頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六三、同種異基因骨髓移植(Allo-BMT)和同種同基因骨髓移植(SBMT)

（一）移植步驟:

1.供受者紅細(xì)胞血型檢測及HLA配型,

應(yīng)用PCR進(jìn)行HLA-A、B、C、DR抗原分型,且HLA相同供受者進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和淋巴細(xì)胞毒交叉試驗(yàn)。

第17頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六2.供者準(zhǔn)備:

詳細(xì)詢問供髓者的病史和全面體檢，對(duì)血、骨髓及心、肝、腎、免疫功能等進(jìn)行檢查。骨髓檢查包括常規(guī)分類、粒-單集落形成測定(GM-CFU)、染色體分析,此外還應(yīng)檢查血清巨細(xì)胞病毒等病毒抗體滴度和華康氏反應(yīng)。第18頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

如為同性供者應(yīng)查紅細(xì)胞同工酶和血型(包括亞型),以此作為移植后骨髓是否植入的依據(jù)。

另外，供髓前4周開始采用自體血保存法儲(chǔ)備自體血600～800毫升。

第19頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六3.受者準(zhǔn)備

預(yù)處理前應(yīng)仔細(xì)體檢；

進(jìn)行痰、尿、糞便、皮膚、耳、鼻、咽拭子細(xì)菌、真菌培養(yǎng)；

預(yù)處理前一周開始口服腸道抑菌劑,；

洗必泰液漱口,洗必泰甘油涂鼻、外耳道,利福平眼藥水滴雙眼等；

注意肛周清潔衛(wèi)生。第20頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

實(shí)驗(yàn)室檢查主要包括骨髓、血及心、肺、肝腎功能等檢查。除做與供者相同的項(xiàng)目外,還應(yīng)查肺功能、X線胸片、如有條件者可做有關(guān)內(nèi)分泌方面的檢查。第21頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

入層流室當(dāng)天剪指甲,剃盡全身毛發(fā),清潔淋浴后用洗必泰液藥浴20～30分鐘,著無菌衣、帽、口罩,用無菌單包裹送入無菌層流室。

入室后保持無菌環(huán)境,進(jìn)無菌飲食,熱量、蛋白質(zhì)和維生素補(bǔ)充要足夠。

工作人員嚴(yán)格進(jìn)行反向隔離。

第22頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六4.骨髓移植前預(yù)處理

預(yù)處理目的是抑制受體免疫系統(tǒng),不使移植的供體造血干細(xì)胞被受體所排斥。各疾病預(yù)處理的方案很多。第23頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六(1)再障和非腫瘤性疾病:

①方案一:單一環(huán)磷酰胺(CTX)靜滴。②方案二:環(huán)磷酰胺和全身照射(CTX+TBI）。

(2)白血病:

①方案一CTX+TBI

②方案二:CTX+柔紅霉素+TBI第24頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六骨髓采集

在手術(shù)室內(nèi)對(duì)供者進(jìn)行骨髓采集。一般應(yīng)用硬膜外麻醉,采髓部位以骼后上棘為最佳,也可在骼前上棘或/和胸骨或/和棘突部位,兒童則需加脛骨處,以多點(diǎn)和不同深度采髓,每點(diǎn)采10～15ml骨骼血,總量10～15ml/Kg(600～1000ml)。第25頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

移植骨髓所需的有核細(xì)胞數(shù)應(yīng)按受（患）者體重和根據(jù)供體來源而定：

（1）SBMT需3.0-5.0×107/Kg

（2）Allo-BMT需》2.0-6.0×108/Kg

當(dāng)采集到400ml時(shí),應(yīng)開始回輸事先采集的自身貯備血,以防休克,術(shù)后需補(bǔ)充各種造血因子。

第26頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（2）過濾

通過17、18號(hào)針頭二次過濾,或不銹鋼網(wǎng)(孔徑0.201～0.307mm)過濾后注射至血袋或采集瓶中。一般吸取的骨髓用生理鹽水或1640稀釋液肝素抗凝,每毫升骨髓血需含肝素15～20單位，以防骨髓血凝集。

第27頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（3）骨髓回輸

★從受者鎖骨下大靜脈插管內(nèi)輸入。

★輸入前將裝有骨髓血的采血袋或采集瓶倒置半小時(shí),使骨髓中脂肪浮于上層,輸注即將結(jié)束時(shí),棄去浮在上層的脂肪滴,以防發(fā)生脂肪栓塞。

★輸畢后須應(yīng)用采髓時(shí)所用肝素劑量的同等劑量魚靜蛋白(1mg魚精蛋白中和100u肝素)。

第28頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（二）Allo-BMT骨髓植活標(biāo)準(zhǔn)

（1）植活的直接證據(jù)：

★受者體內(nèi)出現(xiàn)供者型的性染色體，標(biāo)記型染色體，

★HLA（I、II、和III類）抗原，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板抗原，

★紅細(xì)胞與白細(xì)胞同工酶，同種異型免疫球蛋白以及其它基因標(biāo)記等。

第29頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（2）植活的間接證據(jù)：受者發(fā)生急、慢性GVHD。

（3）骨髓重建的證據(jù)：移植后2－4周，受者網(wǎng)織紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板迅速增高，并逐漸重建造血免疫功能。

第30頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六四、自身骨髓移植

（一）自身骨髓的采集和保存

骨髓的采集在手術(shù)室內(nèi)予以硬膜外麻醉下進(jìn)行，兒童則采用全身麻醉。穿刺部位選擇在左、右前后髂上棘和胸骨，兒童可選擇脛骨上端等部位。

ABMT需有核細(xì)胞總數(shù)5.0～30.0×109（0.5～5.0×108/kg體重），骨髓粒系祖細(xì)胞（CFU－C）平均1.0～4.0×104/kg體重。

第31頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

骨髓液按等量比例與保養(yǎng)液混和，經(jīng)不同孔徑（0.201～0.307mm）的不銹鋼濾網(wǎng)，濾去骨髓中脂肪顆粒和碎片。在混有紅細(xì)胞和骨髓液中每亳升加入肝素15-20U，4℃保存36～48小時(shí)后回輸。也可應(yīng)用10％二甲亞砜作為骨髓冷凍保護(hù)劑，使骨髓保存于－196℃的液氮中。第32頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（二）骨髓凈化

目前國際上將凈化方法分為兩大類：即負(fù)凈化也稱陰性選擇：將腫瘤細(xì)胞從移植物中清除掉；正凈化也稱陽性選擇：將正常造血干細(xì)胞從移植物中分離純化。臨床上應(yīng)用方法多為負(fù)凈化。但無論是物理學(xué)、生物學(xué)或其他方法都還不夠理想。

第33頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（三）自身骨髓移植前預(yù)處理

ABMT的預(yù)處理目的是：①使骨髓產(chǎn)生一定空間，使造血干細(xì)胞有植入和增殖的場所；②進(jìn)一步清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。

精典的方案CTX加全身照射（TBI）或分次全身照射（FTBI）進(jìn)行預(yù)處理。肺需要適當(dāng)屏蔽。

第34頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（四）骨髓回輸：同前

（五）自身骨髓移植后造血功能恢復(fù)（植活標(biāo)志）

ABMT后外周血白細(xì)胞從無恢復(fù)到1.0×109/L平均需16－21天；血小板恢復(fù)50×109/L平均需14－21天，粒細(xì)胞恢復(fù)>0.5×109/l，平均21天。

第35頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六外周血造血干細(xì)胞移植

第36頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六一、外周血干細(xì)移植類型

外周血造血干細(xì)胞移植可分為：（1）自體外周血干細(xì)胞移植（APBSCT）

（2）異基因外周血造血干細(xì)胞移植（Allo-PBSCT)。

供受體選擇及移植前準(zhǔn)備同骨髓移植。

第37頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六二、外周血干細(xì)胞的動(dòng)員與采集

（一）動(dòng)員

在正常生理?xiàng)l件下，外周血干細(xì)胞數(shù)量很少，只有骨髓造血干細(xì)胞量的

1～10％，因此，不能滿足臨床PBSCT數(shù)量的需要。常用動(dòng)員劑有以下幾類：

1．重組人造血生長因子

第38頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六2．抗腫瘤化療藥物

（1）最大限度地殺滅患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞；

（2）在殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)，也使正常造血細(xì)胞受到損害，但由于正常造血細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間比腫瘤細(xì)胞短，故當(dāng)骨髓抑制解除時(shí)和正常造血細(xì)胞恢復(fù)之際，外周血干細(xì)胞數(shù)量反饋性增加達(dá)25～100倍，從而起到了造血干細(xì)胞動(dòng)員效果。國內(nèi)常用藥物有環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷。第39頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

采集前動(dòng)員方案選擇要根據(jù)惡性腫瘤的類型和患者的具體情況而定。

白血病或惡性淋巴瘤晚期等血液系惡性腫瘤作自身的PBSCT時(shí)，以選擇抗腫瘤化療藥物作為動(dòng)員劑量為適宜。

而對(duì)于Allo-PBSCT供者宜選用GM－CSF或G－CSF。

第40頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六（二）采集

1．采集時(shí)機(jī)選擇：

（1）動(dòng)員化療結(jié)束后2－3周，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)升至（1.0-2.0)×109/L時(shí)。倘若單用G-CSF動(dòng)員宜在白細(xì)胞計(jì)數(shù)升至（5.5-10.0）×?xí)r，血小板計(jì)數(shù)50×109/L；

（2）外周血CD34陽性細(xì)胞1％（正常為0.20.1％）。但采集時(shí)機(jī)仍需根據(jù)患者的當(dāng)時(shí)情況而定。

第41頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六2．方法：

運(yùn)用血細(xì)胞分離機(jī)如FenwallCS3000，分離3－4次或COBESPECTRA分離1－2次，直至采集到造血功能重建所需的細(xì)胞數(shù)。

第42頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六四、外周血干細(xì)胞凈化

凈化方法有也是二種：陽性選擇和陰性選擇。

五、外周血干細(xì)胞體外擴(kuò)增

為了確保PBSCT后成功的造血重建，CD34＋細(xì)胞不應(yīng)低于2.5×106/kg。因此，可采用部分CD34＋細(xì)胞進(jìn)行體對(duì)擴(kuò)增。

第43頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六六、外周血干細(xì)胞的凍存

通常每次經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)分離后所得的細(xì)胞懸液約50ml，可加入等量20％二甲基亞砜（DMSO）和RDMI1640保養(yǎng)液，使DMSO的最終濃度調(diào)整至10％。然后分裝于血液凍存袋內(nèi)（每袋100ml）。第44頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六采取二步降溫法：

第一步先1℃/min速率降至－45℃，

第二步則以5～10℃/min降至－80℃～－90℃，程序結(jié)束后，最后將樣品置于－196℃液氮中貯存。第45頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

當(dāng)需要應(yīng)用時(shí)，回輸前將凍存的外周血干細(xì)胞懸液立即置入40～42℃水浴中3min內(nèi)迅速解凍，

然后低溫離心去除含DMSO上清液。

加等量RPMI1640保養(yǎng)液稀釋，每次輸注400～600ml，在1小時(shí)內(nèi)靜脈輸完畢。第46頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六七、外周血干細(xì)胞移植后植活特點(diǎn)

外周血干細(xì)胞移植后，其外周血移植后中性粒細(xì)胞（PMN）上升常出現(xiàn)二個(gè)峰值。

第一次峰值即在PMN恢得到

0.5×

109/L，平均出現(xiàn)在移植后11天，隨后呈一度下降趨勢，然后約在第3～4周時(shí)再次出現(xiàn)第二峰值，至后白細(xì)胞恢得正常。第47頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

目前認(rèn)為第一次PMN峰的出現(xiàn)是由于外周血中較晚造血祖細(xì)胞增殖分化的結(jié)果；第二次峰值的出現(xiàn)則是由于較原始造血干細(xì)胞增殖分化的結(jié)果。而血小板升至

50.0×109/L平均時(shí)間為13天。第48頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六臍血造血干細(xì)胞移植

第49頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六70年代發(fā)現(xiàn)臍血中含有豐富造血細(xì)胞、其數(shù)量和質(zhì)量與骨髓相似。80年代末則用臍血代替骨髓行造血干細(xì)胞移植獲得成功。因此許多國家相繼建立臍血庫，我國也正在籌劃之中，以期有可能解決異基因造血干細(xì)胞移植中遇到的一些難題。

第50頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六一、臍血的采集

臍血可通過臍靜脈穿刺收集，有兩種方式：

(1)胎盤娩出前收集；

(2)胎盤娩出后收集。

采集臍血時(shí)，可用肝素、ACD（枸櫞酸、枸櫞酸鹽和葡萄糖）和CPD（枸櫞酸鹽、磷酸鹽和葡萄糖）作為抗凝劑。

第51頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

每個(gè)胎盤可采集量為42－240（中位數(shù)103）ml，其中約含有核細(xì)胞1.0～2.0×109/l，單個(gè)核細(xì)胞(MNC)1.0×109,CD34細(xì)胞1.0×107

理論上估測足可供體重50公斤以內(nèi)的患者移植之用。

第52頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六二、臍血分離與保存

臍帶血中的造血細(xì)胞可通過羥乙基淀粉沉淀法、密度梯度分離法、流式細(xì)胞儀分離法及單克隆抗體法等，物理生物學(xué)方法分離獲得。

凍存的主要步聚：(1)程控加入20％DMSO（每分鐘加體積的5％，邊加邊攪拌）；（2）程控降溫、凍存。第53頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六三、臍血造干血細(xì)胞擴(kuò)增

原因：單個(gè)臍血中造血干細(xì)胞數(shù)量有限。另外，在臍血樣品分離、凍存、融化、處理和輸注等各個(gè)環(huán)節(jié)中還要損耗一部分細(xì)胞，因此不能滿足成人造血細(xì)胞移植的需要。

擴(kuò)增過程還可清除移植物中殘留T淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的作用，減少GVHD的發(fā)生率。第54頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六四、臍血造血干細(xì)胞移植后植活特點(diǎn)

（1）受者外周血中性粒細(xì)胞絕對(duì)值（ANC）5.0×109/L恢復(fù)所需時(shí)間：同胞相關(guān)供者平均為22天，而無關(guān)供者平均為24天。

（2）血小板計(jì)數(shù)5.0×109/L恢復(fù)所需時(shí)間：同胞相關(guān)供者平均為48天，而無關(guān)供者平均為54天。第55頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六胎肝造血干細(xì)胞移植

第56頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六1958年Uphoff首先發(fā)現(xiàn)對(duì)致死劑量照射小鼠輸注胎肝細(xì)胞懸液后具有促進(jìn)骨髓造血功能恢復(fù)的顯著療效。人們發(fā)現(xiàn)胎齡為3～6個(gè)月胎肝含有極其豐富的造血干細(xì)胞，它和骨髓造血干細(xì)胞相比，有著類似的增殖分化和重建骨髓造血功能的能力，且此時(shí)淋巴細(xì)胞量小于2％，且多為未完全分化成熟的T淋巴細(xì)胞.因此，故移植后GVHD的發(fā)生率低及嚴(yán)重程度輕。

第57頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六一、胎肝造血細(xì)胞制備

人胎肝可以取自水囊引產(chǎn)、前列腺素引產(chǎn)正常胎兒。在無菌條件下，取得肝臟。將肝臟置于培養(yǎng)皿中剪成細(xì)小塊。然后，投入裝有雙層或單層高壓滅菌處理的銅網(wǎng)（孔徑100－200目）的小燒杯，然后倒入約20ml的液體，并用10ml注射器針芯將肝組織塊研磨成漿狀，收集在無菌瓶中，并通過帶4號(hào)針頭的注射器制成單細(xì)胞懸液后備用。第58頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六三、胎肝造血干細(xì)胞分離與貯存

（一）胎肝造血干細(xì)胞分離

在正常肝組織中近半數(shù)肝細(xì)胞和1％的T淋巴細(xì)胞，因此，分離除去這些非造血細(xì)胞有利于胎肝造血干細(xì)胞的超低溫貯存。第59頁，共68頁，2023年，2月20日，星期六

采用直徑為15mm