農(nóng)林牧漁無(wú)菌微生物檢查法方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)例

農(nóng)林牧漁無(wú)菌微生物檢查法方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)例第1頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/72

方法：中國(guó)藥典2005版無(wú)菌檢查中薄膜過(guò)濾法方法驗(yàn)證

驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種：驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種包括金黃色葡萄球菌（26003）、銅綠假單胞菌（10104）、枯草芽孢桿菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心。第2頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/73菌液制備：取經(jīng)34℃培養(yǎng)18～24小時(shí)的金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物1ml加入9ml0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－5～10－7約為50～100cfu/ml備用。取經(jīng)24℃培養(yǎng)18～24小時(shí)的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－5約為50～100cfu/ml備用。第3頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/74

取經(jīng)34℃培養(yǎng)18～24小時(shí)的生孢梭菌硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－7備用。取經(jīng)培養(yǎng)一周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加0.9%氯化鈉溶液3ml，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至另一空管，標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁后，取1ml加入9ml0.9%氯化鈉溶液中10倍稀釋至10－4約為50～100cfu/ml備用。

第4頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/75供試液制備：取樣品10瓶分別加0.1%蛋白胨溶液30ml溶解后，過(guò)濾。7.活菌計(jì)數(shù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。第5頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/7610－4稀釋

10－5稀釋

10－7稀釋

試驗(yàn)次數(shù)121212金黃色葡萄球菌

5660

枯草芽孢桿菌

7779

白色念珠菌

8670

黑曲霉菌8076

銅綠假單胞菌

4750第6頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/77

方法驗(yàn)證直接接種法：取樣品12支，分別接種8支硫乙醇酸鹽和4支霉菌液體培養(yǎng)基2ml/支后，再按要求加入相應(yīng)的陽(yáng)性菌液（30-100個(gè)/ml），置規(guī)定溫度培養(yǎng)3-5天，逐日觀察結(jié)果。第7頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/78薄膜過(guò)濾法：取樣品11支，將樣品過(guò)濾于封閉式濾器（3聯(lián)筒/套），用0.1%蛋白胨氯化鈉溶液沖洗500ml后，再分別人工污染金黃色葡萄球菌、枯草桿菌50~100個(gè)/筒即可，同時(shí)平行做稀釋劑的對(duì)照組。將稀釋劑對(duì)照濾筒和污染陽(yáng)性菌的驗(yàn)證濾筒置37℃-培養(yǎng)3～5d，逐日觀察，結(jié)果見(jiàn)表2、3、4。

第8頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/79第9頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/710第10頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/711第11頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/712結(jié)論：根據(jù)上述結(jié)果，由于采用直接接種法進(jìn)行虎杖苷注射液的無(wú)菌檢查，存在對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的無(wú)菌檢查應(yīng)依據(jù)中國(guó)藥典無(wú)菌檢查方法中的薄膜過(guò)濾法進(jìn)行，沖洗量規(guī)定為500ml。

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頭孢噻肟鈉無(wú)菌原料的無(wú)菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證

樣品：頭孢噻肟鈉無(wú)菌原料，規(guī)格：0.5g/瓶；批號(hào)：40807001；生產(chǎn)單位：AventisPharmaDeutschlandGmbH培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通斜面、真菌斜面、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、虎紅瓊脂(均由中國(guó)藥品生物制品檢定所培養(yǎng)基室提供)β-內(nèi)酰胺酶：2ml大于300單位/毫升（批號(hào)：20030630）第13頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/714驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種：（1）金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；

(2)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]；

(3)大腸埃希菌（Escherichiacoli）

[CMCC(B)44102]；

(4)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]；（5)生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]；

(6)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；

(7)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]。

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儀器和濾器：HTY-2000A集菌儀，全封閉無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)濾培養(yǎng)器（批號(hào)20050105）北京牛牛基因有限公司。

方法：中國(guó)藥典2005年版無(wú)菌檢查的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

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操作方法菌液制備：取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,32.5±2.5℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；第16頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/717

取經(jīng)32.5±2.5℃培養(yǎng)19~21h小時(shí)的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌肉湯培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至約10-5~10-8之間。取經(jīng)36℃培養(yǎng)18~22h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，混勻備用。第17頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/718

白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中[見(jiàn)附錄1.3],25.5±2.5℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。取經(jīng)25.5±2.5℃培養(yǎng)72小時(shí)的白色念珠菌真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水4ml洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，取1ml加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，取1.2ml加生理鹽水9ml，混勻備用。

第18頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/719

將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25.5±2.5℃培養(yǎng)5～7d，使大量的孢子成熟。取經(jīng)25℃培養(yǎng)7d的黑曲霉真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水4ml洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，稀釋至10-4，取0.5ml加生理鹽水10ml混勻備用。第19頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/720菌液計(jì)數(shù)：分別取上述5種細(xì)菌菌液1ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入營(yíng)養(yǎng)瓊脂約18ml。30~35℃培養(yǎng)（生孢梭菌置厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）。分別取上述2種真菌菌液1ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入虎紅瓊脂約18ml。23~28℃培養(yǎng)。

第20頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/721供試液制備：每2支以100ml生理鹽水溶解，混勻備用。薄膜過(guò)濾：將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，每次50ml，在最后一次的沖洗液中逐一加入試驗(yàn)菌少于100CFU。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。每天觀察并記錄結(jié)果。第21頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/722陽(yáng)性對(duì)照：另取濾筒，不過(guò)濾供試品，其它操作同上，作為陽(yáng)性對(duì)照，將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5天。各試驗(yàn)菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進(jìn)行驗(yàn)證。取未加樣品的濾器分別加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基5桶及真菌培養(yǎng)基2桶，100ml/桶。陰性對(duì)照：兩個(gè)濾器桶內(nèi)各過(guò)濾生理鹽水200ml，然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100ml，不加對(duì)照菌液，分別于30-35℃及23-28℃培養(yǎng)。第22頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/723

培養(yǎng)：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基桶30-35℃培養(yǎng)；真菌培養(yǎng)基桶23-28℃培養(yǎng)。觀察結(jié)果。結(jié)果細(xì)菌和真菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。

第23頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/724表1細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù)

表2真菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果

菌種大腸埃希菌金黃色葡萄球菌

枯草芽孢桿菌

銅綠假單胞菌

生孢梭菌

計(jì)數(shù)(CFU)22263639626658542020均值(CFU)2438645620菌種黑曲霉菌

白色念珠菌

計(jì)數(shù)(CFU)86938683均值(CFU)8985第24頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/725實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和表4表3細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(20小時(shí)觀察)

大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌生孢梭菌沖洗量800ml72h(-)++++沖洗量1000ml

++++陽(yáng)性對(duì)照+++++第25頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/726表436小時(shí)觀察真菌結(jié)果

黑曲霉菌白色念珠菌沖洗量200ml++沖洗量400ml++陽(yáng)性對(duì)照++第26頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/727

大腸埃希菌菌液制備：取經(jīng)35℃培養(yǎng)19~20h的大腸埃希菌肉湯培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，取0.4ml加鹽水10ml混勻，做活菌計(jì)數(shù)備用。

取12支樣品，每2支以100ml生理鹽水溶解，沖洗100ml每次，做沖300、500ml、800ml二桶，各加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml和β-內(nèi)酰胺酶2支。分別加入大腸桿菌菌液（肉湯培養(yǎng)物10倍稀釋至10-7）1ml。結(jié)果見(jiàn)表5。

第27頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/728表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果（大腸埃希菌菌數(shù)54CFU）

培養(yǎng)時(shí)間14h25h38h110h沖洗量300ml----沖洗量500ml--++沖洗量800ml-+++陽(yáng)性對(duì)照++++第28頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/729結(jié)論：

頭孢噻肟鈉無(wú)菌原料無(wú)菌檢查法:,取樣量3.0克，采用薄膜過(guò)濾法（封閉濾器為北京牛牛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。沖洗液為0.9％的氯化鈉溶液，沖洗量800ml，加酶量2支（大于300單位/ml）以大腸埃希菌為陽(yáng)性對(duì)照菌。

第29頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/730復(fù)方磷酸可待因（歐博士止咳露）溶液微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

樣品：復(fù)方磷酸可待因（歐博士止咳露），批號(hào)309315、402021，生產(chǎn)廠家為香港歐化藥業(yè)有限公司。驗(yàn)證用菌種：

枯草桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、

黑曲霉CMCC(F)98003。方法：

中國(guó)藥典有關(guān)微生物限度檢查法方法驗(yàn)證試驗(yàn)。

第30頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/731具體操作方法菌液制備：取經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水，10倍稀釋至10-5~10-7，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。(2)取經(jīng)25℃培養(yǎng)18~24小時(shí)的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水10倍稀釋至10-5~10-7，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。第31頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/732

取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3~5ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，

用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，然后取1ml+9ml鹽水，逐管10倍稀釋為10-4，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。

供試液制備：

吸取樣品10ml，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液90ml濃度均為1：10供試液，分別人工污染上述5種代表試驗(yàn)菌株。

第32頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/733回收率測(cè)定：試驗(yàn)組:分別取不同品種的1：10供試液1ml、50~100個(gè)/ml試驗(yàn)菌株同時(shí)加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~72小時(shí)觀察結(jié)果。薄膜過(guò)濾法以最后一次的沖洗液加入試驗(yàn)菌.(2)活菌組

測(cè)定每一菌株的試驗(yàn)菌數(shù)(3)供試液對(duì)照

測(cè)定供試品本底菌數(shù)(4)稀釋劑對(duì)照組第33頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/734結(jié)果菌落計(jì)數(shù)結(jié)果、常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法在復(fù)方磷酸可待因微生物限度檢查法的驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表1、2和表3。第34頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/735表1菌落計(jì)數(shù)（cfu/ml）

實(shí)驗(yàn)次數(shù)金葡菌10-5枯草桿菌10-5白色念珠菌10-5黑曲霉10-4大腸埃希菌10-7194、90130、8073、72110、9014、15280、7445、23128、108110、12054、343153、15078、7773、74110、10030、27第35頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/736表2復(fù)方磷酸可待因微生物限度檢查方法驗(yàn)證

（常規(guī)法）

實(shí)驗(yàn)次數(shù)人工染菌回收率%金葡菌枯草桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌10.0271.481.1100.0100.0229.229.4100.0100.0100.03抑菌抑菌100.0100.0100.0第36頁(yè)/共42頁(yè)2023/3/737從表2結(jié)果可以看出:（1）采用常規(guī)方法檢驗(yàn)復(fù)方磷酸可待因溶液供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗(yàn)均高于70%，可采用常規(guī)方法檢