基因工程抗體和抗體工程培訓(xùn)課件

基因工程抗體和抗體工程Cgenescodefortheconstantregionsofimmunoglobulinproteinchains.

Vgeneissequencecodingforthemajorpartofthevariable(N-terminal)regionofanimmunoglobulinchain.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes

2基因工程抗體和抗體工程Figure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes3基因工程抗體和抗體工程Figure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes4基因工程抗體和抗體工程Table24.1EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes

FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>1000985基因工程抗體和抗體工程Figure24.5ThelambdaCgenesegmentisprecededbyaJsegment,sothatV-Jrecombinationgeneratesafunctionallambdalight-chaingene.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes6基因工程抗體和抗體工程Figure24.6ThekappaCgenesegmentisprecededbymultipleJsegmentsinthegermline.V-JjoiningmayrecognizeanyoneoftheJsegments,whichisthensplicedtotheCgenesegmentduringRNAprocessing.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes7基因工程抗體和抗體工程Figure24.7Heavygenesareassembledbysequentialjoiningreactions.FirstaDsegmentisjoinedtoaJsegment;thenaVgenesegmentisjoinedtotheDsegment.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes8基因工程抗體和抗體工程Figure24.8ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.Thediversityofgermlineinformation

9基因工程抗體和抗體工程Figure24.9ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.Thediversityofgermlineinformation

10基因工程抗體和抗體工程Figure24.10Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.Thediversityofgermlineinformation

11基因工程抗體和抗體工程Figure24.12Consensussequencesarepresentininvertedorientationateachpairofrecombiningsites.Onememberofeachpairhasaspacingof12bpbetweenitscomponents;theotherhas23bpspacing.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangements

12基因工程抗體和抗體工程Figure24.13Breakageandreunionatconsensussequencesgeneratesimmunoglobulingenes.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangements13基因工程抗體和抗體工程Figure15.8Reciprocalrecombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem;eachproductofrecombinationhasonecopyofthedirectrepeat.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangements14基因工程抗體和抗體工程Figure15.9Reciprocalrecombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.15基因工程抗體和抗體工程一、噬菌體抗體庫技術(shù)的

基本方法⒈獲取目的基因⒉抗體庫技術(shù)的載體⒊淘篩⒋表達(dá)與鑒定16基因工程抗體和抗體工程

它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與PⅢ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對(duì)噬菌體表面的抗體分子進(jìn)行篩選。噬菌體抗體庫技術(shù)17基因工程抗體和抗體工程

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。噬菌體表面展示系統(tǒng)(phagesurfacedisplaysystem)18基因工程抗體和抗體工程19基因工程抗體和抗體工程

噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn):

外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段20基因工程抗體和抗體工程用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，21基因工程抗體和抗體工程該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):

將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;

可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù);

抗體基因篩選的范圍廣;

技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn);

適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。22基因工程抗體和抗體工程

噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細(xì)胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識(shí)別一增殖過程上模擬了B細(xì)胞的成熟過程，從而在實(shí)際應(yīng)用上具有很大意義。23基因工程抗體和抗體工程24基因工程抗體和抗體工程25基因工程抗體和抗體工程26基因工程抗體和抗體工程二、噬菌體抗體庫技術(shù)的

特點(diǎn)⒈模擬天然全套抗體庫⒉避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)⒊可獲得高親和力的人源化抗體27基因工程抗體和抗體工程

單克隆抗體噬菌體抗體

雜交瘤技術(shù)展示技術(shù)宿主細(xì)胞:雜交瘤細(xì)菌篩選范圍:~103107109時(shí)間:幾個(gè)月幾周操作:繁雜相對(duì)簡單免疫:必須可避免人源抗體:+費(fèi)用:高低生產(chǎn)量:有限無限基因獲取:再克隆直接應(yīng)用前景:有限不可估

28基因工程抗體和抗體工程三、基因工程抗體表達(dá)⒈原核細(xì)胞表達(dá)⒉真核細(xì)胞表達(dá)⒊轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)⒋轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)29基因工程抗體和抗體工程第六節(jié)抗體診斷試劑一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑⒈鑒定病原菌的抗體試劑⑴常用診斷血清的品種和用途①沙門氏菌屬診斷血清②志賀氏菌屬診斷血清③病原性大腸埃希氏菌診斷血清30基因工程抗體和抗體工程⑵診斷血清的制備步驟①制備細(xì)菌抗原②免疫動(dòng)物和制備抗體血清⑶診斷血清診斷方法31基因工程抗體和抗體工程32基因工程抗體和抗體工程⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動(dòng)血凝診斷試劑⒊妊娠診斷試劑⒋抗ABO血型系統(tǒng)血清33基因工程抗體和抗體工程34基因工程抗體和抗體工程二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體

類試劑⒈熒光抗體診斷試劑⑴熒光抗體的制備⑵免疫熒光測(cè)定方法⒉免疫酶抗體診斷試劑⑴免疫酶染色法用抗體診斷試劑⑵酶免疫測(cè)定用抗體診斷試劑①HBsAg酶標(biāo)診斷試劑②HBeAg酶標(biāo)診斷試劑35基因工程抗體和抗體工程③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標(biāo)診斷試劑④測(cè)定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo)抗體診斷試劑⑤甲胎蛋白（AFP）酶標(biāo)抗體診斷試劑⑥癌胚抗原（CEA）的酶標(biāo)抗體診斷試劑36基因工程抗體和抗體工程⒊放射免疫用抗體診斷試劑放射免疫技術(shù)是將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來建立的檢測(cè)技術(shù)。放射性核素標(biāo)記抗體的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法38基因工程抗體和抗體工程抗原的測(cè)定有：①夾心法②間接法③竟?fàn)幏?9基因工程抗體和抗體工程3.競(jìng)爭法Ag※Ag※Ab+AbAg(標(biāo)本)(定量)AgAbEE終止液標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色顯色固相固相標(biāo)本酶標(biāo)二抗底物1.夾心法2.間接法40基因工程抗體和抗體工程①HBsAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑②HBeAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑③HAV抗原放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑④AFP放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑⑤CEA放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑常用標(biāo)記抗體試劑有：41基因工程抗體和抗體工程三、導(dǎo)向診斷藥物

放射性核素標(biāo)記抗體腫瘤放射免疫顯像放射免疫顯像優(yōu)點(diǎn)：①在體內(nèi)確切腫瘤定位作用，準(zhǔn)確性達(dá)90%，靈敏度達(dá)100%。②在體內(nèi)可檢出0.5cm大小的病灶，并可檢出肺腦的轉(zhuǎn)移灶。42基因工程抗體和抗體工程③小分子抗體易到達(dá)腫瘤部位，可顯著提高N/NT值。④抗體在腫瘤部位可保留6～9日⑤能觀擦抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。43基因工程抗體和抗體工程

放射免疫顯像定位技術(shù)將抗腫瘤單克隆抗體（Ab）與二乙基三胺五乙酸（DTPA）在體外偶聯(lián)成Ab-DTPA，再注入體內(nèi)后，就能與體內(nèi)組織相結(jié)合。由于抗體分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DTPA是重金屬離子絡(luò)合劑，所以In-113M可以結(jié)合到DTPA分子上，使腫瘤組織顯像。這一過程在2小時(shí)內(nèi)可完成。44基因工程抗體和抗體工程

建立預(yù)定位技術(shù)需解決3個(gè)問題：①抗體在腫瘤組織滯留要7天以上。②Ab-DTPA偶聯(lián)物比較穩(wěn)定；③內(nèi)源性金屬離子對(duì)DTPA的封閉作用要小。45基因工程抗體和抗體工程第六節(jié)抗體治療藥物以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟。一、放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡便用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。46基因工程抗體和抗體工程二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物⒈常用的抗癌藥物氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細(xì)胞毒性體高二倍。47基因工程抗體和抗體工程⒉抗體類藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性腫瘤細(xì)胞對(duì)抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR）。

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