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文檔簡(jiǎn)介

關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR第1頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

一、PCR的定義:

PCR(polymerasechainreaction):聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。第2頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

DNA擴(kuò)增的傳統(tǒng)方法:一般采用分子克隆法,需將構(gòu)建的含有目的基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,并需要用探針進(jìn)行篩選,牽扯到DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及探針雜交等技術(shù),雖然技術(shù)上已無難點(diǎn),但操作復(fù)雜,需數(shù)周到數(shù)月的時(shí)間,且不利于普及。第3頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

PCR技術(shù):1985年由美國(guó)Cetus公司的KaryMullis

首創(chuàng),可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上。優(yōu)點(diǎn):敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等,廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域,并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室,大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù),從而比較容易地對(duì)目的基因進(jìn)行分析、鑒定。

KaryMullis

本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第4頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

二、PCR的原理:

用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段,類似于天然DNA的復(fù)制過程。

以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板,以一對(duì)分別與模板5′末端和3′末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成,重復(fù)這一過程,即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。第5頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合,基本反應(yīng)步驟分三步:1.變性

(Denaturation):加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。94℃30″2.退火(復(fù)性)(Annealling):

突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合,也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合,但由于引物的高濃度,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn),主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。55℃30″第6頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

3.延伸

(Extension):

將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度,在DNA聚合酶、4種dNTPs及鎂離子等存在的條件下,以引物的3′端開始,結(jié)合單核苷酸,形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。72℃1′

上述3步為一個(gè)循環(huán),每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,經(jīng)過25~40個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106~109倍。第7頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第8頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五第9頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五第10頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

PCR擴(kuò)增的特異性是由一對(duì)寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期,原來的DNA擔(dān)負(fù)起使模板的作用,隨著循環(huán)次數(shù)的遞增,由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板,最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5’端之間的DNA片段。第11頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

三、PCR的成分和作用:終濃度

1.緩沖液:

10

~50mMTris-Cl(pH8.4)

維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性

25~50mMKCl

促進(jìn)引物退火,>50mM會(huì)抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白

(BSA)

對(duì)酶有一定的保護(hù)性,如質(zhì)量不好將起相反的作用,建議使用乙?;腂SA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。第12頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五2.MgCl2:

1.5

~2.0mMTaq酶具有Mg2+依賴性,顯著影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量,過量能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率,過低則酶活性顯著下降。第13頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物

0.02~0.2mMdNTPs可與Mg2+結(jié)合,應(yīng)注意Mg2+濃度與dNTPs

濃度之間的關(guān)系,Mg2+濃度比dNTPs濃度高0.2~2.5mM。過高:加快反應(yīng)速度,還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和室驗(yàn)成本。過低:反應(yīng)速度下降,可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。第14頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五4.引物(Primer-P):預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列,決定特異性。

0.2~1μM

偏高:非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配,增加引物之間形成引物二聚體,產(chǎn)量降低。偏低:產(chǎn)量降低。第15頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五5.TaqDNA聚合酶:耐高熱

0.5~5U/100μl

1U/25~50μl

偏高:引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增偏低:產(chǎn)物量降低第16頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五6.模板DNA(Template):

最低102

~105bpDNA片段,實(shí)際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此量,用量需在實(shí)驗(yàn)中摸索。1~5μl

過高:非特異產(chǎn)物增加過低:產(chǎn)量降低7.水:

去離子水,補(bǔ)足整個(gè)反應(yīng)體積。第17頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

四、PCR反應(yīng)體系:

常用30μl

各種成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲(chǔ)備液濃度進(jìn)行核算。第18頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五10×buffer:1×30/10=3μlMgCl2:1.5×30/25=1.8μldNTPs:0.2×30/10=0.6μl

引物P:0.4×30×2/10=2.4μlTaq酶(5U/μl):1/5=0.2μl

模板:1μl

水:30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl第19頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

操作:

5份標(biāo)本總體積30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管,依次加入下列試劑:

10×buffer:3μl×6=18μlMgCl2:1.8μl×6=10.8μldNTPs:0.6μl×6=3.6μl

引物P:2.4μl×6=14.4μlTaq酶(5U/μl):0.2μl×6=1.2μl

水:21μl×6=126μl

共174μl,先用移液器/指彈混勻,后用離心機(jī)瞬時(shí)混勻(管壁上液體沉至管底)。第20頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五2.另取5支0.2mlEp管,分別加入上述液體29μl。3.分別取標(biāo)本模板各1μl,加入上述5支Ep管中,混勻,分別加入2滴液體石蠟(防止加溫過程中液體蒸發(fā)影響反應(yīng)體積),離心機(jī)瞬時(shí)離心,備用。4.反應(yīng)條件:PCR擴(kuò)增儀

94℃30″,55℃30″,72℃1′,

35個(gè)循環(huán),72℃延伸5′。

第21頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

五、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:

1、溫度、循環(huán)參數(shù):

⑴變性溫度和時(shí)間:

保證模板DNA解鏈完全是保證整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95℃,30~60s,再?gòu)?fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度,可以調(diào)整變性溫度和時(shí)間。一般情況下選擇94℃30″,可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng),可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。第22頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

⑵復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度的選擇,可根據(jù)引物的長(zhǎng)度和G+C含量確定,長(zhǎng)度在15~25bp之間時(shí),復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算得到,一般位于40~60℃,30~60s。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。第23頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

⑶延伸溫度和時(shí)間:一般位于Taq酶最適作用溫度70~75℃之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75℃。延伸反應(yīng)時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,<1Kb,1分鐘足夠;>1Kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間,10Kb片段延伸時(shí)間可達(dá)15分鐘。延伸時(shí)間過長(zhǎng)可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,常用72℃1′。

第24頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

⑷循環(huán)數(shù):其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20~25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴(kuò)增增加。第25頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

2、MgCl2濃度:可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性

1.5

~2.0mM

過高:增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率過低:酶活性顯著下降。

第26頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

3、引物:

0.2~1μM

偏高:非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配,增加引物之間形成引物二聚體,產(chǎn)量降低。偏低:產(chǎn)量降低。引物設(shè)計(jì)原則:總原則是提高擴(kuò)增的效率和特異性第27頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五

引物設(shè)計(jì)原則⑴長(zhǎng)度15~30b,過短特異性降低,過長(zhǎng)則成本增加,產(chǎn)量也下降。⑵引物堿基盡可能隨機(jī)分布,避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象,引物G+C含量宜在45~55%左右。⑶引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列,否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu),兩個(gè)引物之間尤其在3’末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在,不然會(huì)形成引物二聚體。第28頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五引物設(shè)計(jì)原則⑷引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性(<70%)或少于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。⑸引物的5′末端堿基:并沒有嚴(yán)格的限制,只要與模板DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠,其5′末端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態(tài)。最多可游離10個(gè)堿基并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行。第29頁(yè),共34頁(yè),2023年,2月20日,星期五引物設(shè)計(jì)原則⑹引物的3′

末端堿基:原則上要求引物的3′末端與模板DNA一定要配對(duì),另外3′末端的末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。引物3′末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異,

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