發(fā)酵工業(yè)的種子制備

第五章發(fā)酵工業(yè)的種子制備節(jié)、種子制備原理與技術(shù)

第二節(jié)、影響種子質(zhì)量的因素第三節(jié)、種子質(zhì)量的控制措施第四節(jié)、種子制備放大技術(shù)實(shí)例發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!節(jié)種子制備原理與技術(shù)一、概述二、種子罐級數(shù)的確定三、種子質(zhì)量的判斷方法四、種子制備技術(shù)概要發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!種子培養(yǎng)的概念是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過搖瓶或扁瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。一、概述發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的接種量的需要菌種的馴化；縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!二、種子罐級數(shù)的確定

種子擴(kuò)大的級數(shù)：制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)級數(shù)愈少，愈利于簡化工藝及控制，并可減少種子罐污染雜菌的機(jī)會，減少消毒及值班工作量，減少因種子罐生長異常而造成的發(fā)酵波動級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!三、種子質(zhì)量的判斷方法通常檢測的培養(yǎng)液中參數(shù)pH是否在種子要求的范圍之內(nèi)糖、氨基氮、磷酸鹽的含量菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀有無雜菌污染其他參數(shù)，如接種前酶活、種子罐的溶氧和尾氣等

發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!（一）種子制備過程實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!（二）實(shí)驗(yàn)室種子制備階段目的：將種子擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點(diǎn)最終的培養(yǎng)物可分為兩類：

對于不產(chǎn)孢子和芽孢的微生物

——獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子——菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。對于產(chǎn)孢子的微生物獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體——便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!1、培養(yǎng)基選擇的原則在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長，并去處變異株。所以接種時要稀一點(diǎn)、便于純化生長到單菌落。子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接種：①從母斜面上點(diǎn)接種，選取生長好的單菌落②接種時密一點(diǎn)，得到大量的孢子。孢子培養(yǎng)時注意濕度，子斜面使用一般不超過1個月孢子培養(yǎng)發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!1、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因:

一是成本二是馴化發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。

在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級數(shù)的確定是非常重要的一個方面發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!4、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!在放射形土壤桿菌多糖（ARPS）發(fā)酵過程中不同的接種量對多糖產(chǎn)量的影響發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!5、種子的質(zhì)量要求量：要求達(dá)到一定的濃度質(zhì):形態(tài)（生長處于某個階段、均勻等等）理化指標(biāo)：C、N、P的含量，pH酶活等無污染發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!原材料質(zhì)量原材料質(zhì)量波動引起種子質(zhì)量不穩(wěn)定原材料質(zhì)量波動的主要原因：無機(jī)離子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量）發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!濕度濕度低，孢子生長快濕度大，孢子生長慢

制備土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子時發(fā)現(xiàn)，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干癟狀，孢子稀少。發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!斜面冷藏時間

對孢子的生產(chǎn)能力有較大影響冷藏時間越長，生產(chǎn)能力下降越多

鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月的降低18％，比冷藏3個月的降低35％。

發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!pH

選擇最適種子培養(yǎng)pH的原則是獲得最大比生長速率和適當(dāng)?shù)木颗囵B(yǎng)最后一級種子的培養(yǎng)基的pH應(yīng)接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，以便種子能盡快適應(yīng)新的環(huán)境發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!第四節(jié)種子制備放大技術(shù)實(shí)例一、細(xì)菌發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)二、酵母發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)三、絲狀真菌發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)四、放線菌發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)五、谷氨酸生產(chǎn)種子制備六、青霉素生產(chǎn)種子制備發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!梭狀芽孢桿菌發(fā)酵丁醇－丙酮時種子擴(kuò)大培養(yǎng)的程序舉例：

發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!面包酵母的種子擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!不能產(chǎn)生無性孢子的用繁殖體菌絲作為接種物，如生產(chǎn)赤霉素的菌種——藤倉赤霉問題：難以獲得均一的接種物接種前將菌絲打成碎片，形成大量的菌絲段，它具有大量的生長點(diǎn)利用菌絲體作為接種物

三、絲狀真菌發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)

發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!制備過程斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵五、谷氨酸生產(chǎn)種子制備發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!2、一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250mL,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!種子的質(zhì)量要求：108-109個/mL大小均勻，呈單個或八字排列pH7.0-7.2時結(jié)束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!1、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于長孢子，用量少而精細(xì)培養(yǎng)條件：25℃、7天,注意濕度50%左右發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!3、一級種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長菌體培養(yǎng)條件：27℃，40小時接種量：200億孢子/噸4、二級種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時接種量：10%發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!本章小節(jié)：了解種子擴(kuò)培的工藝過程及其中的基本概念理解種子擴(kuò)培的目的和要求掌握控制種子質(zhì)量的基本方法和手段發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!優(yōu)良種子應(yīng)具備的條件生長活力強(qiáng)，延遲期短；生理狀態(tài)穩(wěn)定；濃度及總量能滿足發(fā)酵罐接種量的要求；無雜菌污染，保證純種發(fā)酵；適應(yīng)性強(qiáng)，生產(chǎn)能力穩(wěn)定發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!確定方法菌種的性質(zhì)(如菌種傳代后的穩(wěn)定性)瓶中的孢子數(shù)，孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量種子罐與發(fā)酵罐的容積比隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定隨著工藝條件的改變作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!四、種子制備技術(shù)概要步驟：斜面培養(yǎng)基中活化；扁瓶固體培養(yǎng)基或搖瓶培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，完成實(shí)驗(yàn)室種子制備一級種子罐，制備生產(chǎn)用種子；視情況確定擴(kuò)大級數(shù)，完成生產(chǎn)車間種子制備；種子轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!1、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長。菌種產(chǎn)孢子能力強(qiáng)及孢子發(fā)芽、生長繁殖迅速，可用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子菌種產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢，可用搖瓶液體培養(yǎng)法不產(chǎn)孢子的菌種，保藏基礎(chǔ)上，在一定溫度下活化即可發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!2、起始接種物的傳代問題

細(xì)菌保藏斜面→活化斜面產(chǎn)孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌種的傳代次數(shù)盡可能的少。發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!（三）生產(chǎn)車間種子制備階段在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。縮短發(fā)酵時間有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利：發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!2、發(fā)酵級數(shù)的確定谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）→二級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子（小罐）→二級種子（中罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計(jì)算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從級種子罐開始計(jì)算發(fā)酵級數(shù)。發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!3、接種量的確定

移入種子的體積接種量＝—————————接種后培養(yǎng)液的體積接種量過多，菌絲生長過快、溶氧不足，衰老細(xì)胞增加等，發(fā)酵后勁不足種量過少延長發(fā)酵周期，形成異常形態(tài)，而且易造成染菌以生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度為依據(jù)接種量的大小直接影響發(fā)酵周期發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!大量地接入培養(yǎng)成熟的菌種的優(yōu)點(diǎn)：縮短生長過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率節(jié)約發(fā)酵培養(yǎng)的動力消耗有利于減少染菌機(jī)會發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!放射形土壤桿菌多糖（ARPS）發(fā)酵過程中不同的接種齡對多糖產(chǎn)量的影響發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!第二節(jié)影響種子質(zhì)量的因素原材料質(zhì)量培養(yǎng)溫度濕度通氣與攪拌斜面冷藏時間培養(yǎng)基pH發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!培養(yǎng)溫度

溫度過低，菌種生長發(fā)育緩慢溫度過高會使菌絲過早自溶在制備土霉素生產(chǎn)種子過程中，高于37℃培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。

發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!通氣與攪拌

足夠的通氣量，以保證菌種代謝正常，提高種子的質(zhì)量攪拌可提高通氣效果，促進(jìn)生長繁殖，過度攪拌導(dǎo)致培養(yǎng)液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化變性，泡沫過多增加染菌機(jī)會，增加能耗絲狀微生物不宜劇烈攪拌發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!培養(yǎng)基培養(yǎng)種子的目的：擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量同時也必須培養(yǎng)出強(qiáng)壯、健康、活性高的細(xì)胞。為了使細(xì)胞迅速進(jìn)行分裂或菌絲快速生長種子培養(yǎng)基特點(diǎn)：有較完全和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，糖分少，需充足氮源和生長因子，無機(jī)氮源比例大各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高供孢子用的種子培養(yǎng)基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!第三節(jié)種子質(zhì)量的控制措施

菌種穩(wěn)定性的檢查

測定其生產(chǎn)能力，從中挑選高產(chǎn)菌株，并及時對退化菌種進(jìn)行復(fù)壯

提供適宜的生長環(huán)境種子無雜菌檢查，保證純種發(fā)酵種子液生化分析項(xiàng)目主要有：營養(yǎng)基質(zhì)的消耗速度、pH變化、溶氧變化、色澤和氣味等。發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!一、細(xì)菌發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)菌發(fā)酵過程中種子擴(kuò)大培養(yǎng)的主要目的是為了獲得大量的活力強(qiáng)的種子種齡對于生芽孢的種子尤其重要。若接種物含大量芽孢，將給后續(xù)發(fā)酵帶來較長遲滯期發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!二、酵母發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)釀酒酵母的種子擴(kuò)大培養(yǎng)

最初采用純種進(jìn)行酵母發(fā)酵并設(shè)計(jì)出酵母繁殖流程，他將每一步的接種量規(guī)定為10％，并控制繁殖條件與釀造時一致現(xiàn)代的流程中，接種量為1%或更低，控制的條件也與釀造時不同發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!在固化的培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子“滾瓶”技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)黃青霉的孢子生產(chǎn)在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子在谷類的顆粒表面形成大量的孢子在液體深層培養(yǎng)基中產(chǎn)生孢子利用孢子作為接種物

灰黃霉素產(chǎn)生菌展青霉一試驗(yàn)表明在良好的通氣條件下，培養(yǎng)基中含氮是在0.05～0.1％（w/v）之間時，可以產(chǎn)生大量的孢子三、絲狀真菌發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)

發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!四、放線菌發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)，制備孢子懸浮液作初級種子可用培養(yǎng)搖瓶菌絲體作為初級種子

發(fā)酵工業(yè)的種子制備共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求