2022年醫(yī)學(xué)專題-胰蛋白酶的脫鹽及精制方法

胰蛋白酶的脫鹽及精制(jīngzhì)方法

組員(zǔyuán)：

白佳幸

張

鑫

江茹蘭、梁美芳1第一頁，共十七頁?；?jīběn)簡介脫鹽精制(jīngzhì)提取(tíqǔ)操作2第二頁，共十七頁。一、胰蛋白酶(yídànbáiméi)簡介胰蛋白酶系自牛、羊或豬胰中提取的一種蛋白水解酶，這種肽鏈內(nèi)切酶，只斷裂(duànliè)賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。白色或米黃色結(jié)晶性粉末，溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量為24000，最適pH值7.8～8.5左右，當(dāng)pH>9.0時(shí)不可逆失活。Ca2+對(duì)酶活性有穩(wěn)定作用；重金屬離子、有機(jī)磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制劑對(duì)其活性有強(qiáng)烈抑制。3第三頁，共十七頁。作用(zuòyòng)用途本品為蛋白質(zhì)水解酶，能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，能消化溶解變性蛋白質(zhì)，對(duì)未變性的蛋白質(zhì)無作用，因此，能使膿痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生，此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于動(dòng)物(dòngwù)細(xì)胞培養(yǎng)前對(duì)組織的處理。工業(yè)上用于皮革制造、生絲處理、食品加工等。4第四頁，共十七頁。二、提取(tíqǔ)操作—分離原理在動(dòng)物胰臟中除了存在胰蛋白酶外，還有另外兩種與胰蛋白酶性質(zhì)相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。在胰蛋白酶提取過程中，三者彼此很難分開。需采用合適的方法進(jìn)一步分離純化。從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸將胰腺細(xì)胞中含有的胰蛋白酶原提取出來(chūlái)，然后根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理將提取液的pH值調(diào)至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出來(chūlái)。沉淀物經(jīng)水溶解并調(diào)至pH8.0，用極少量的胰蛋白酶將胰蛋白酶原激活，同時(shí)溶液中的胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原也被激活，三種酶原相互作用過程如下：5第五頁，共十七頁。也可采用從胰臟中提取出胰蛋白酶原，利用合適的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通過溶液中Ca2+的環(huán)境，使胰蛋白酶原被開始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘囊鹊鞍酌福ㄒ饶榈鞍酌冈皬椥缘鞍酌冈嗤瑫r(shí)被胰蛋白酶激活成有活性的酶）。激活后的酶溶液再進(jìn)一步分離(fēnlí)純化。6第六頁，共十七頁。［試劑(shìjì)和器材］1、試劑（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液

（2）10%（積分?jǐn)?shù)）乙酸（3）2mol/L硫酸

（4）固體硫酸銨（5）無水CaCl2

（6）結(jié)晶胰蛋白酶(yídànbáiméi)

（7）25%乙醇溶液(含0.015mol/ＬHCl、0.05mol/ＬCaCl2)

（8）95%乙醇

（9）5mol/ＬN(yùn)aOH

（10）丙酮7第七頁，共十七頁。2、器材

（1）胰臟

（2）組織搗碎機(jī)

（3）離心機(jī)

（4）磁力攪拌器

（5）透析袋、20目篩網(wǎng)、紗布、水浴鍋

（6）燒杯、量筒、刻度吸管、試管、玻璃(bōlí)漏斗

（7）布氏漏斗、抽濾瓶、溫度計(jì)、滴管、玻璃攪棒、紗布、pH試紙等8第八頁，共十七頁。［方法(fāngfǎ)和步驟］方法(fāngfǎ)一

1、胰蛋白酶原的提取取新鮮豬胰臟約150g，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重100g，切成碎塊，在組織搗碎機(jī)中搗碎，并加入2倍體積預(yù)冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液，制成勻漿。漿液倒入500mL燒杯中，用10%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸調(diào)節(jié)pH在2.5～3.0之間，在5～10℃下提取6h以上，并間隙輕輕攪拌。用4層紗布過濾，盡量擠出濾液。組織殘?jiān)性偌尤?.5倍體積（約50mL左右）預(yù)冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4層紗布過濾。合并兩次濾液，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)濾液pH在2.5～3.0之間，4℃放置4h（pH始終保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折疊濾紙于玻璃漏斗中自然過濾，收集濾液，量取體積（約200mL左右）。濾液中加入粉末狀固體硫酸銨，使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492g，5℃）。放置過夜，使胰蛋白酶原完全析出。次日抽濾，棄濾液，壓緊并收集濾餅，即胰蛋白酶原粗品。9第九頁，共十七頁。2、胰蛋白酶原的激活將胰蛋白酶原粗品稱重（濕重），分次加入10倍體積預(yù)冷的蒸餾水（按濾餅重量計(jì)算），使濾餅完全溶解（一般情況濾餅中硫酸銨含量約占餅重1/4）。用5mol/LNaOH將溶液調(diào)至pH8.0，慢慢地?cái)嚢柘录尤牍腆w無水CaCl2使溶液的Ca2+終濃度達(dá)到0.1mol/L（要減去一部分氯化鈣與硫酸銨結(jié)合(jiéhé)生成硫酸鈣的鈣離子）。取出2mL溶液用于測定激活前的蛋白含量及酶活性。原溶液中加入5mg結(jié)晶胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋白酶原活化。每隔1h取樣測定胰蛋白酶活性增長情況，直至酶激活速度變慢或停止增長。一般比活可達(dá)到3500～4000BAEE單位/mg。留取2mL溶液用于測定激活后的蛋白質(zhì)含量和酶活性。激活酶溶液用2mol/L硫酸調(diào)pH至2.5～3.0，濾紙過濾，濾去硫酸鈣沉淀，收集濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?0第十頁，共十七頁。方法二

稱取冷凍豬胰臟100g，在2～5℃下解凍，切成小塊，用組織搗碎機(jī)中絞碎成胰漿，在5～10℃存放24h以上，使胰酶自身活化。胰漿中加入25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加0.015mol/LHCl、0.05mol/LCaCl2），搗碎機(jī)中搗碎1min。胰漿倒入500mL燒杯中，間隙攪拌，溫度20℃左右，活化5～6h。每隔1.5h，吸取2mL活化液用于測定激活后的蛋白質(zhì)含量和酶活性?；罨磻?yīng)結(jié)束后，胰漿3500r/min離心20min，將離心后上清液用二層紗布過濾。濾液置250mL燒杯中，以過濾清液的體積為準(zhǔn)，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使溶液硫酸銨飽和度為20%。放置6h后，3500r/min離心20min，保存上清液待用，取沉淀。沉淀分別用適量95%乙醇洗滌(xǐdí)過濾，再用丙酮洗滌(xǐdí)，過濾。最后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅰ。11第十一頁，共十七頁。在上述離心(líxīn)上清液中，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使上清液溶液達(dá)到55%硫酸銨飽和度，放置6h后，3500r/min離心(líxīn)30min，取離心(líxīn)沉淀，分別用適量95%乙醇、丙酮洗滌，過濾后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ。12第十二頁，共十七頁。三、脫鹽精制—離子交換(lízǐjiāohuàn)層析法原理：同類型的帶電離子間可自由地相互交換和競爭結(jié)合。蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)以下（pH＜pI），帶正電荷，可被陽離子交換樹脂所吸附；相反則帶負(fù)電荷，可被陰離子交換樹脂所吸附。上步實(shí)驗(yàn)中所得的豬胰蛋白酶等電點(diǎn)為pI=10.8，在pH=5.0的緩沖液中豬胰蛋白酶帶正電，可被陽離子交換樹脂吸附（本實(shí)驗(yàn)用CM-纖維素離子交換樹脂）；則帶負(fù)電的雜蛋白不被吸附而除去，帶正電的雜蛋白也被吸附，但不同蛋白與樹脂的吸附能力不同，通過增加緩沖液中的離子強(qiáng)度及提高pH，可將蛋白從樹脂上洗脫下來。在不同的離子強(qiáng)度下，可將不同的蛋白分別洗脫（結(jié)合力弱的蛋白最先洗脫，結(jié)合力強(qiáng)的蛋白最后洗脫）。通過以上離子交換層析法，即可將目的(mùdì)蛋白和雜蛋白分開，從而得到純化。

13第十三頁，共十七頁。14第十四頁，共十七頁。具體步驟1、柱的平衡：用0.01mol/L，pH5.0檸檬酸鈉緩沖液平衡CM-纖維素離子交換柱2、樣品吸附：用恒流泵直接上樣于CM-纖維素離子交換柱3、洗滌：以0.01mol/L，pH5.0檸檬酸鈉緩沖液充分洗凈未吸附蛋白質(zhì)4、洗脫1：用0，,05mol/L，pH5.0檸檬酸鈉緩沖液洗脫，并收集部分樣品，測定每個(gè)樣品的蛋白含量，做層析曲線，將出現(xiàn)一個(gè)層析峰，此峰值為豬胰凝乳蛋白酶5、洗脫2：待胰凝乳蛋白酶峰過后，改用0.1mol/L，pH6.0檸檬酸鈉緩沖液洗脫，并分部收集樣品，重復(fù)(chóngfù)上步步驟，將出現(xiàn)一個(gè)蛋白峰，此峰值為豬胰蛋白酶6、柱的再生15第十五頁，共十七頁。感謝(gǎnxiè)觀賞3/3/202316第十六頁，共十七頁。內(nèi)容(nèiróng)總結(jié)胰蛋白酶的脫鹽