干擾技術(shù)基本原理與應(yīng)用

關(guān)于干擾技術(shù)基本原理與應(yīng)用第1頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三什么是RNA干擾RNA干擾(RNA

interference，RNAi),又稱(chēng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，是指將特異性同源雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，使目的基因的不表達(dá)或表達(dá)水平下降.2001、2002年連續(xù)被Science評(píng)為年度十大成就!第2頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三目前應(yīng)用的基因干擾技術(shù)DNA水平的基因干擾技術(shù)基因敲除技術(shù)寡核苷酸與雙鏈DNA雜交采用多胺等小分子識(shí)別并阻遏特定轉(zhuǎn)錄因子第3頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三目前應(yīng)用的基因干擾技術(shù)mRNA水平的基因干擾技術(shù)用反義RNA技術(shù)阻遏翻譯過(guò)程,破壞內(nèi)源性mRNA設(shè)計(jì)寡核苷酸來(lái)破壞與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì),使mRNA不穩(wěn)定雙鏈RNA干擾技術(shù)（RNAi）第4頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1984年,Jonathan研究小鼠L細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)反義mRNA會(huì)干擾同源基因的表達(dá)，機(jī)制不清1990年Jorgensen等矮牽牛顏色加深實(shí)驗(yàn)“共抑制(co-suppresion)”第5頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1995年SuGuo和KenEmphues

反義RNA阻斷秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)par-1基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象1998年AndrewFire和CraigMello

發(fā)現(xiàn)單鏈RNA抑制作用較弱，而純化的dsRNA可高效、特異地抑制基因的表達(dá)

Nature1998；391:806-11

正式提出RNA干擾的概念第6頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1999年Tuschl等報(bào)道在哺乳動(dòng)物中也存在RNAi2001年Berstein等提出只有22核苷酸dsRNA才有特異性的阻斷效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)體內(nèi)分解dsRNA為siRNAs(short/smallinterferingRNA)的DICER酶第7頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程2002年Novina等用RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)HIV-1病毒的阻抑2004年Morris等用RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)人細(xì)胞基因的抑制

Science2004(August27)；305：1289-1292第8頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi的主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默具有高度的特異性抑制基因表達(dá)的高效性可在不同細(xì)胞之間傳遞甚至傳到子代中去“基因沉默系統(tǒng)化”第9頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三siRNA與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶

共同點(diǎn)特異性靶向性第10頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三siRNA與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶

不同點(diǎn)獨(dú)特的雙鏈結(jié)構(gòu)需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等協(xié)同因子siRNA本身無(wú)催化活性在細(xì)胞內(nèi)可能具有相對(duì)的穩(wěn)定性具有一定的可遺傳性第11頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi的主要過(guò)程啟動(dòng)階段

dsRNA(500nt左右最佳)被Dicer酶特異性識(shí)別，以一種ATP依賴(lài)的方式逐步切割成siRNA長(zhǎng)度：21-25nt結(jié)構(gòu)：3ˊ端懸垂兩個(gè)未配對(duì)的堿基UU第12頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞中內(nèi)源性dsRNA的形成基因組中DNA反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物同時(shí)轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA病毒RNA復(fù)制中間體以單鏈RNA為模板由細(xì)胞或病毒的RNA依賴(lài)RNA聚合酶(RdRp)催化合成dsRNA第13頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Dicer酶RNAaseIII超家族成員。結(jié)構(gòu)中包括一個(gè)螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域，一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合位點(diǎn)對(duì)單鏈RNA沒(méi)有活性對(duì)200~500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA廣泛存在第14頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RdRp（RNAdependentRNApolymerase）使異常的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA參與細(xì)胞內(nèi)dsRNA和siRNA的擴(kuò)增siRNA與靶mRNA的結(jié)合可激活RdRp，形成大量的dsRNA第15頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi的主要過(guò)程效應(yīng)階段RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的形成RISC的激活：ATP依賴(lài)的解雙鏈過(guò)程在siRNA反義鏈的指導(dǎo)下(靶序列的識(shí)別），RISC特異性切割、降解靶mRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)失活

第16頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第17頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法siRNA的設(shè)計(jì)原則序列大小19-21nt，最好以A或G開(kāi)始從mRNA的AUG開(kāi)始，尋找AA二連序列，作為潛在的RNAi靶位點(diǎn)不要針對(duì)5‘和3’端非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs)

第18頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法siRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)2~4個(gè)序列,BLAST比對(duì)基因序列以確保序列設(shè)計(jì)的特異性?xún)?yōu)先選擇GC含量30-50%的序列設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照序列第19頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三陰性對(duì)照序列的設(shè)計(jì)特異性siRNA中的堿基進(jìn)行隨機(jī)排列，且行BLAST基因比對(duì)

AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGATTCGTGCTCAATGCAATCG在特異性siRNA引入1~2個(gè)錯(cuò)配堿基

AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGTTTAAATCCTAG第20頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三目標(biāo)序列篩選的相關(guān)網(wǎng)站/Stu/shilin/rnai.html/sirna.pl/rnai/http://RNAiD/rnaidesigner/:9331/RNAi/html/rnai.html

第21頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三查找已經(jīng)證實(shí)的siRNA的網(wǎng)站/catalog/category.aspx?key=49/techlib/tb/tb_502.html/mmcmanus/www/siRNADB.html/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published

第22頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三siRNA的制備方法體外制備方法化學(xué)合成siRNA體外轉(zhuǎn)錄獲取siRNA利用Dicer或RNaseⅢ消化長(zhǎng)的dsRNA成siRNA第23頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三化學(xué)合成法制備siRNA優(yōu)點(diǎn)：純度高合成量不受限能被標(biāo)記缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴、合成周期長(zhǎng)用途：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究

第24頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三體外轉(zhuǎn)錄法制備siRNA優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單成本低速度快毒性小穩(wěn)定性好

缺點(diǎn)：反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制用途：篩選siRNAs，特別是需要制備多種

siRNAs

第25頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三siRNA的制備方法細(xì)胞內(nèi)制備方法依賴(lài)表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體在細(xì)胞內(nèi)獲取siRNA通過(guò)PCR介導(dǎo)的siRNA表達(dá)試劑盒獲取siRNA第26頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三siRNA載體依賴(lài)RNA聚合酶III啟動(dòng)子(polIII)，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。人源U6啟動(dòng)子鼠源的U6啟動(dòng)子人H1啟動(dòng)子polIII可在細(xì)胞中表達(dá)許多的小分子RNA，通過(guò)添加一串（3~6個(gè)）U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈再克隆到載體中

第27頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三表達(dá)載體法制備siRNA優(yōu)點(diǎn)：可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究。載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因達(dá)數(shù)星期或更久缺點(diǎn)：需要進(jìn)行克隆，周期長(zhǎng)，質(zhì)粒載體表達(dá)效率較低用途：唯一可以用于長(zhǎng)期基因沉寂研究的方法第28頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基于PCR的siRNA表達(dá)框架(SECs)

組成：RNApolIII啟動(dòng)子發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNARNApolIII終止位點(diǎn)制備：PCR，無(wú)需克隆和測(cè)序第29頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三用SECs制備siRNA優(yōu)點(diǎn)：可直接由PCR得到，方法簡(jiǎn)便，時(shí)間短在PCR片段兩端添加酶切位點(diǎn)，篩選出最有效的siRNA可用于構(gòu)建表達(dá)載體可以用來(lái)篩選特定研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配

第30頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三用表達(dá)框架制備siRNA缺點(diǎn)：PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中不能進(jìn)行序列測(cè)定，PCR和DNA合成時(shí)可能產(chǎn)生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想

用途：篩選siRNA序列在將siRNA克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子

第31頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第32頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第33頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第34頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三shRNA(shorthairpinRNA)文庫(kù)

Nature2004；428：427-431(25March)

針對(duì)：9,610humangenes5,563mousegenes

構(gòu)建成：28,000個(gè)shRNA表達(dá)盒(cassettes)商品化試劑盒：ExpressionArrest?(美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室OpenBiosystems公司)

網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇特定的shRNA克隆，無(wú)需再耗時(shí)耗力進(jìn)行siRNA的設(shè)計(jì)、合成和驗(yàn)證過(guò)程第35頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三CAM:氯霉素抗性基因hr：同源重組位點(diǎn)Barcode：每個(gè)shRNA獨(dú)特的識(shí)別序列MSCV：病毒載體骨架PKG-Puro：哺乳動(dòng)物細(xì)胞中載體穩(wěn)定性的選擇Kan、oriT、RK6：逆轉(zhuǎn)錄病毒信號(hào)序列第36頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三siRNAshRNA使用代價(jià)高相對(duì)較低持久性最多2周可選擇獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞宿主類(lèi)型細(xì)胞系原代細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞、細(xì)胞系設(shè)計(jì)復(fù)雜的設(shè)計(jì)方法完成獲取需要合成完成應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、病毒侵染檢測(cè)方法Western雜交、表型分析RT-PCR、芯片檢測(cè)Western雜交、表型分析、RT-PCR、芯片檢測(cè)研究領(lǐng)域細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)&體內(nèi)研究第37頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第38頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第39頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第40頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

.磷酸鈣共沉淀電穿孔法DEAE-葡聚糖和polybrene機(jī)械法：顯微注射和基因槍陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑

第41頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三提高轉(zhuǎn)染效率的方法純化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染較低傳代數(shù)的細(xì)胞合適的轉(zhuǎn)染試劑合適的陽(yáng)性對(duì)照熒光標(biāo)記的siRNA

第42頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因組功能研究的新方法研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑開(kāi)展基因治療的新策略（抗病毒、抗腫瘤等）篩選藥物靶點(diǎn)的新工具第43頁(yè)，共48頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RNAi技術(shù)抗病毒作用阻止病毒入侵、抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄自然界中普遍存在在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用RNA病毒：如HIV