臨床免疫學-移植免疫與配型

移植免疫與配型

授課內容一、器官移植及其相關的基本概念二、排斥反應的種類及其發(fā)生機制三、移植前需進行哪些實驗室檢查四、血型的概念及血型鑒定五、HLA的概念及HLA配型方法六、PRA的概念及檢測方法七、移植后需要做哪些檢查移植免疫的發(fā)展史1596年，意大利外科醫(yī)生進行最早一次成功的自體組織移植.19世紀初，嘗試異體皮膚移植,但因排斥而失敗。1940年，Medewar證實了同種異體移植排斥是一種免疫現象.1954年，美國醫(yī)生Murray在單卵雙生姐妹間進行腎移植獲得成功。

1954年美國Murray第1次腎移植成功

★開創(chuàng)了人類腎臟、心臟、肝臟以及其他器官移植手術的先河。Murray在1990年獲得了諾貝爾醫(yī)學獎器官移植的發(fā)展史JosephE.Murray

JosephE.Murray

器官移植的發(fā)展史1962年，應用HLA分型技術選擇合適的供體，第一次用無親緣關系的供體腎進行異體移植，獲得成功。1963年肝移植、肺移植1966年胰腺移植

1967年心臟移植80年代初，由于環(huán)孢素A等應用，明顯提高了器官移植的成功率，器官移植已廣泛應用于臨床。移植手術水平的改善解剖結構爛熟于心顯微外科飛速發(fā)展藝高人膽大器官保存技術的提高單純冷卻灌洗機器持續(xù)灌注深低溫保存離體器官可以用含氧無血溶液進行保存灌洗，開創(chuàng)科學家研究低溫灌洗器官保存時代。AlexisCarrel免疫抑制劑成功使用Voronoy1933年腎臟移植失?。縅osephE.Murray

1962年尸腎移植成功！硫唑嘌呤！PeterBrianMedawar：1942年首次揭開移植排斥之謎，創(chuàng)立移植免疫學免疫抑制劑成功使用免疫移植免疫→移植排斥移植排斥→免疫本質和過程：MHC、T細胞發(fā)育、生物學功能、免疫耐受免疫機制的闡明→移植耐受：免疫抑制劑、移植配型免疫抑制劑：1950s：x線全身照射1960s：硫唑嘌呤+激素——基本用藥1970s：多克隆抗體（抗淋巴細胞球蛋白ALG和抗胸腺球蛋白ATG)——選擇用藥1980s：環(huán)孢素A，進入CsA時代 單克隆抗體（CD3單抗）1990s：他克莫司(FK506)和毒酚酸酯(MMF)90年代中后期：雷帕霉素未來趨勢：誘導免疫耐受11

一、器官移植及其相關的基本概念

移植（transplantation):將一個個體的一部分通過手術或其他方法移到另一個體的特定部位，繼續(xù)保持活力并發(fā)揮功能，以治療疾病或挽救生命。移植物（graft）：被移植的細胞，組織或器官的統(tǒng)稱供者（Donor）：獻出移植物的個體受者（Recipient）：接受移植物的個體器官移植（organtransplatation)

應用自體或異體的正常細胞、組織、器官置換病變或功能缺損的細胞、組織或器官，以維持和重建機體生理功能。細胞移植：造血干細胞等組織移植：皮膚組織等器官移植：肝腎心肺腸等13器官移植的種類14donor-recipient遺傳學關系自體移植：auto-transplant同質移植：iso-transplant異體移植：allo-transplant異種移植：xeno-transplant遺傳學分類自體移植(autologoustransplantation)

同系移植(isograft)單卵雙生間、純系動物間的移植同種異體移植(isogeneictransplantation)同種間不同個體的移植，具遺傳基因、MHC差異異種移植(xenotransplantation)異種動物間的移植：種間差異性更大

異種移植（Xenotransplantation)轉基因豬------組織和器官的最佳來源受精卵DNA表達人MHC異種之間的移植一般會失?。煌环N系內不相關的個體之間的移植常常要失敗；自體移植總是能成功；同種異體的受體對首次移植物排斥時間較長，但再次接受同一供體的移植物，則迅速被排斥；受體與供體間的血緣關系愈近，移植愈可能成功。移植排斥反應的規(guī)律21

移植抗原（組織相容性抗原）

概念：引起移植排斥反應的抗原類型：

1.主要組織相容性抗原

2.次要組織相容性抗原

3.血型抗原

4.組織特異性抗原

22

1.主要組織相容性抗原能引起強烈排斥反應的組織相容性抗原稱為主要組織相容性抗原即MHC（MajorHistocompatibilityComplex）抗原，在人類又稱為人類白細胞抗原HLA（HumanLeukocyteAntigen）。

位于一對同源染色體上對應位置的一對基因稱為等位基因（allele）；由于群體中的突變，同一座的基因系列稱為復等位基因。HLA復合體的每一座存在為數眾多的復等位基因，由于各個座位基因是隨機組合的，故人群中的基因型可達108之多。A5A10B40B16A1A2B8B35甲（6#）乙（6#）A5，A10，B40，B16復等位基因

一對等位基因同為顯性稱為共顯性。HLA復合體中每一個等位基因均為共顯性，從而大大增加了人群中的HLA表型的多樣性，達到107數量級。因此除了同卵雙生者外，無關個體間HLA型別完全相同的可能性極小。A2A10B40B16A1A2B8B35HLAmolecule：A1，A2，B8，B35

甲甲乙乙HLAmolecule：A2，A10，B40，B16

共顯性表達27

DPDQDR

C4

C2

BCA人類MHC(HLA)基因結構

II類III類I類HLA抗原可根據不同基因位點的產物和它們的功能加以分類。第一類抗原：HLA-A，HLA-B，HLA-C

第二類抗原：HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP

第三類抗原：C4A，C4B，C2，Bf等補體成分28多基因座復等位基因的存在基因共顯性表達HLA的高度多態(tài)性（polymorphism）沒有血緣關系的兩個人HLA幾乎沒有相同的可能HLA基因存在豐富多態(tài)性：

A約27、B約50C約10、DR約23DP約6、DQ約9HLA抗原命名（第12屆國際會議）HLA-AHLA-BHLA-CHLA-DRHLA-DQHLA-DPA1B5B78Cw1DR1DQ1DPw1A2B7B47Cw2DR103DQ2DPw2A203B703B48Cw3DR2DQ3DPw3A210B8B49(21)Cw4DR3DQ4DPw4A3B12B50(21)Cw5DR4DQ5(1)DPw5A9B13B51(5)Cw6DR5DQ6(1)DPw6A10B14B5102Cw7DR6DQ7(3)A11B15B5103Cw8DR7DQ8(3)A19B16B52(5)Cw9(w3)DR8DQ9(3)A23(9)B17B53Cw10(w3)DR9A24(9)B18B54(22)DR10A2403B21B55(22)DR11(5)A25(10)B22B56(22)DR12(5)A26(10)B27B57(17)DR13(6)A28B2708B58(17)DR14(6)A29(19)B35B59DR1403A30(19)B37B60(40)DR1404A31(19)B38(16)B61(40)DR15(2)A32(19)B39(16)B62(15)DR16(2)A33(19)B3901B63(15)DR17(3)A34(10)B3902B64(14)DR18(3)A36B40B65(14)DR51A43B4005B67DR52A66(10)B41B70DR53A68(28)B42B71(70)A69(28)B44(12)B72(70)A74(19)B45(12)B73A80B46B75(15)B76(15)B81B77(15)Bw4Bw6

注：括號中為寬型抗原歷年發(fā)現HLA抗原和基因的情況31II類基因區(qū)III類基因區(qū)I類基因區(qū)編碼編碼HLA-II類分子HLA-I類分子補體成分等32MHCI類和II類分子的結構、分布和功能特點特征MHCI類分子MHCII類分子基因HLA-A,B,CHLA-DP,DQ,DR分子結構

α+β2mα+β抗原肽結合區(qū)a1+a2a1+β1肽結合槽大小8～12aa13～17aa組織分布和表達所有有核細胞表面APC，激活的T細胞特異性免疫中識別和遞呈內源性識別和遞呈外源性的功能抗原肽，與共受體CD8

抗原肽，與共受體CD4

結合，限制Tc殺傷功能結合，限制Tc殺傷功能

33MHCI類分子接納抗原肽為8-12個氨基酸內源性抗原遞呈途徑外源性抗原遞呈途徑MHCII類分子接納抗原肽為13-17個氨基酸CD8＋TCD4＋T34

2.次要組織相容性抗原在供、受者間MHC完全相同的情況下，仍會發(fā)生排斥反應，引起這種較弱而緩慢排斥反應的組織相容性抗原稱為次要組織相容性抗原(minorhistocompatibilityantigen,mHA)。此類抗原是表達于機體組織細胞表面的同種異型抗原，由種群內某些多態(tài)性基因編碼，可被MHC分子提呈。mHA主要包括兩類：性別相關的mHA和常染色體編碼的mHA35次要組織相容性抗原的概念

位于細胞內有別于MHC分子的具有同種差異的抗原肽必須和MHC分子結合被APC直接提呈通常引起弱而遲緩的細胞免疫反應36次要組織相容性抗原的反應特點

一般屬非膜蛋白，主要誘導細胞免疫受MHC分子約束只有在體內致敏后，才能在體外檢測不同個體中，參與排斥反應的mH抗原不盡相同大多引起遲緩的排斥反應37

3.其他同種異型抗原人類ABO血型抗原：不僅分布在紅細胞表面，也存在于肝、腎等組織細胞和血管內皮細胞表面，供、受者ABO血型不合也可引起移植排斥反應。組織特異性抗原：特異性表達于某一器官、組織或細胞表面的抗原。在多種組織特異性抗原中，研究較深入的是內皮細胞(vascularendothelialcell，VEC)特異性抗原和皮膚的SK抗原。二、排斥反應的種類及其發(fā)生機制

移植排斥（transplantationrejection)

是宿主針對移植抗原或移植物針對宿主抗原產生的免疫應答，從而導致移植物功能喪失或受者機體損害的過程。排斥反應的本質：T細胞介導的、針對移植抗原的免疫應答

識別“自己”與“非己”記憶性特異性可經淋巴細胞轉移40超急性排斥反應急性排斥反應慢性排斥反應移植排斥反應類型

（一）據其發(fā)生的快、慢和病變特點分為：移植排斥反應的分類和特點類型反應時間反應機制超急性術后數分鐘至幾小時受者體內事先存在的天然抗體加急性1~5天T淋巴細胞急性7~14天T淋巴細胞慢性數月至數年抗體、補體、內皮細胞增生42（二）根據排斥對象分為：1、宿主抗移植物反應（hostversusgraftreaction,HVGR）:受者對供體器官產生的排斥反應。2、移植物抗宿主反應（graftversushostreaction,GVHR）:移植物中的淋巴細胞對宿主的組織抗原產生免疫應答并引起組織損傷。43

（三）移植排斥反應的免疫學特點1、移植抗原的提呈識別2、排斥反應的免疫效應機制441、移植物抗原的提呈與識別1）由供體APC進行的抗原提呈

——直接提呈

2）由受體APC進行的抗原提呈

——間接提呈45受者T細胞46直接提呈的特點

提呈完整的同種異型MHC分子激活大量T細胞克?。?-10%T細胞總數）

主要引起急性排斥反應對免疫抑制治療敏感47間接提呈的特點

提呈經處理的同種異型MHC抗原肽激活少量T細胞克?。?.01%T細胞總數）

主要引起慢性排斥反應對免疫抑制治療不敏感492、排斥反應的免疫效應機制

抗體：預存抗體的作用移植物誘導抗體的作用

T細胞：CD4+細胞的作用

CD8+細胞的作用炎癥因子：粘附分子的作用細胞因子的作用50（四）同種異基因移植排斥反應的類型及效應機制超急性排斥反應急性排斥反應慢性排斥反應血管接通后數分鐘至數小時移植后數天至2周移植后數月至數年HVGR511.超急性排斥反應預存抗體（ABO血型抗體；術前反復輸血、懷孕、再次移植等）抗原（血管內皮細胞表面）激活補體直接破壞靶細胞活性片段引起血管通透性增高和中性粒細胞浸潤和損傷纖維蛋白沉積和大量血小板聚集血管炎癥反應、血管內凝血出血器官不可逆性缺血、變性、壞死522.急性排斥反應細胞免疫排斥體液免疫排斥CD4+Th介導的遲發(fā)型超敏反應性損傷CD8+CTL的細胞毒效應補體激活急性間質炎急性血管炎533.慢性排斥反應由多因素參與急性排斥反應的延續(xù)CD4+Th和巨噬細胞相關的慢性炎癥反復多次抗體或細胞介導的內皮損傷細胞損傷誘發(fā)持續(xù)分泌多種生長因子(如胰島素樣生長因子、血小板源性生長因子、轉化生長因子等）導致血管壁增厚、間質纖維化間質纖維化、移植物內血管硬化三、移植前需進行哪些實驗室檢查?常規(guī)檢測血型鑒定HLA配型PRA常規(guī)檢測血尿糞常規(guī)肝腎功、電解質、血氣出凝血微生物四、血型的概念及血型鑒定血型（bloodgroup)：

血液各成分以抗原為表現形式、由血型基因所決定的遺傳性狀，是血液系統(tǒng)的一種遺傳多態(tài)性，包括紅細胞血型、血小板血型、白細胞血型等。狹義的血型一般指紅細胞血型。

血型鑒定ABO血型Rh血型ABO血型ABO抗原是強組織相容性抗原紅細胞表面血型抗原+血清抗體 正向定型：抗體鑒定抗原 反向定型：抗原鑒定抗體四種血型：A、B、AB、OABO血型凝集試驗ABO血型鑒定正向定型反向定型Rh血型常見D、E、C、c、e抗原Rh陰性漢族<1%受者Rh陰性，供者必須陰性(第一次一般無問題)傳統(tǒng)方法：凝集試驗新方法：流式細胞儀 液相芯片 生物芯片等五、HLA的概念及HLA配型方法

HLA概念： 人類白細胞抗原（humanleukocyteantigen),由HLA基因復合體編碼的產物，因最初是在白細胞表面發(fā)現，故得名。主要表達于細胞膜，或游離存在于血液和體液中，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類。參與免疫應答和免疫調節(jié)，與移植排斥反應密切相關。

HLA復合體位于6號染色體短臂上。

國外統(tǒng)計：3位點6個抗原均匹配時，移植腎的10年存活率為62%，5抗原為47%，4抗原為45%，3抗原為40%，無1匹配時為33%，說明HLA配型可減少移植物的同種異型抗原性，有助于提高移植物的長期存活率。10090807060504030201001年2年同卵雙生子（N=12）HLA一致的同胞（N=765）尸體捐獻者（N=3974）HLA不一致的同胞（N=951）%移植物存活率67HLA的檢測：血清學檢測細胞學檢測基因檢測HLA配型681、血清學分型法

補體介導的微量細胞毒試驗

原理：

抗體(HLA分型)+淋巴細胞(受者)+補體淋巴細胞受損判定結果（細胞死亡百分率）主要應用：檢測HLA-A、B、C抗原

69技術要點（1）分離待檢的淋巴細胞，經洗滌、計數后，配成一定濃度。檢測HLA-Ⅱ類抗原時，需分離B淋巴細胞。（2）取分型板，加入標準抗血清和待檢淋巴細胞，充分混勻，溫育。（3）加入補體，溫育。（4）加臺盼藍/伊紅染色死細胞。（5）用倒置顯微鏡觀察計數死細胞的百分數。

HLA抗體測步驟:CDC染色固定觀察結果孵育一小時

0-10%11-20%21-50%51-80%81-100%1陰性2可疑陰性

4弱陽性6陽性

8強陽性試驗結果判定標準

72

2.細胞學分型法

混合淋巴細胞培養(yǎng)法（MLC)

分為：單向法和雙向法原理：

單向法：淋巴細胞（供者，X線或絲裂霉素處理）

+淋巴細胞(受者)培養(yǎng)淋巴母細胞(判定結果)；

雙向法：淋巴細胞(供者)+淋巴細胞(受者)

培養(yǎng)淋巴母細胞(判定結果)。

主要應用：檢測DR抗原734天3H-胸腺嘧啶混合淋巴細胞4小時計量放射性g-射線PBLPBL

混合淋巴細胞反應混合淋巴細胞培養(yǎng)74

原理：比較供、受者編碼HLA抗原基因的DNA序列，判定供、受者間的相似程度。主要方法：

(1)PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)法

(2)PCR-SSO(序列特異性寡核苷酸)法

(3)PCR-SSP(序列特異性引物）法(4)SBT(Sequencing-BasedTyping)

3、基因分型法

“骨髓庫”構建原理76限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）

根據不同個體間的HLA相應堿基序列在不同部位存在多個不同酶切位點，通過一組限制性內切酶消化、識別、切割這些位點，產生數量和長度不一的DNA酶解片段，經電泳分離，與相應的cDNA探針進行雜交，即可分析限制性片段長度多態(tài)性，借以確定HLA的型別，這種HLA分型法稱為DNA-RFLP。若對DNA片段進行體外擴增，然后再進行RFLP分析，則可大大提高RFLP的敏感度和特異性，這種引入DNA體外擴增技術的限制性片段長度多態(tài)性分析則稱為PCR-RFLP分型法。77PCR-SSOP

PCR-SSOP分型法是將待檢細胞HLA基因片段經PCR擴增后轉移至NC膜或尼龍膜上，然后與放射性核素（32P）、生物素或地高辛等標記的探針進行雜交，若待檢DNA與已知核苷酸序列的探針互補，則兩者結合，即可分析出待檢DNA序列，據此確定HLA的基因型別。78PCR-SSP分型法

PCR-SSP是根據HLA堿基序列的多態(tài)性和已知的DNA序列設計出一套針對每一等位基因的特異性引物，SSP只能和相應等位基因特異片段的堿基互補性結合。通過PCR技術將待檢DNA擴增，產生相對應的特異性擴增產物，通過電泳分析確定HLA型別。HLA-DRB1等位基因PCR-SSP分型引物序列

Table1.SenseprimersquenceofHLA-DRB1allelestypingbyPCR-SSP

HLA-DRB1

Allele

Primersequence5’end

Primersequence3’end

0101

TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT

CTGCACTGTGAAGCTCTCAC

1501

TCCTGTGGCAGCCTAAGAG

CCGCGCCTGCTCCAGGAT

1601

TCCTGTGGCAGCCTAAGAG

AGGTGTCCACCGCGGCG

0301

TACTTCCATAACCAGGAGGAGA

TGCAGTAGTTGTCCACCCG

0405

GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA

CTGCACTGTGAAGCTCTCAC

1101

GTTTCTTGGAGTACTCTACGTC

CTGGCTGTTCCAGTACTCCT

1202

AGTACTCTACGGGTGAGTGTT

CACTGTGAAGCTCTCCACAG

1301

TACTTCCATAACCAGGAGGAGA

CCCGCTCGTCTTCCAGGAT

1401

GTTTCTTGGAGTACTCTACGTC

TCTGCAATAGGTGTCCACCT

0706

CCTGTGGCAGGGTAAGTATA

CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC

0803

AGTACTCTACGGGTGAGTGTT

CTGCAGTAGGTCTCCACCAG

80D-mix+DNA+Taq每孔加DNA標本、Taq酶和D-mix每孔包括兩套引物特異性引物內對照引物MICROSSP

微量SSP試劑盒原理HLA基因分型HLA-DRHLA-AHLA-BHLA-C82四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)：聚合反應中，ddNTP會隨機取代dNTP，使新合成的DNA鏈無法繼續(xù)延伸脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)/雙脫氧核苷三磷酸

(ddNTP)3‘少一個羥基四種不同染料標記的ddNTPSanger雙脫氧法原理Sanger雙脫氧法原理SeCore?I類位點試劑盒A、B以及Cw位點

單管多段擴增，分成2個片段A位點（Exon1、2、3以及4、5）B位點（Exon2、3以及4、5）Cw位點（Exon1、2、3以及4、5、6)6個測序引物對Exon2、3、4進行雙向測序A位點B位點Cw位點990bp950bp1375bp1100bp1400bp1370bpMWABCwLocationofaminoacidvariabilitythatresultsinmultipledifferentHLAclassImoleculesExon212Exon43Exon1LeaderExon3SeCore?II類位點測序試劑盒DRB1單管擴增系統(tǒng)300bp的擴增產物已包含Codon86反向TG測序混合液MWDRB1—DQB1位點測序試劑盒分別對Exon2和Exon3進行兩管擴增—DPB1位點測序試劑盒LocationofaminoacidvariabilitythatresultsinmultipledifferentHLAclassIImoleculesExon21/12/2Exon1LeaderExon393

四種常用的HLA-DNA分型方法主要指標比較方法 試驗時間 操作成本 精確度效率 自動化PCR-SSO

Directdot-blot + + +++ ++ +++

- Reversedot-blot

+ + +++ ++ +++

- PCR-SSP +++ ++ ++ ++ -

+ PCR-RFLP + + + + -

- SEQUENCING - - - ++++-

+ ++++：極佳+++：最佳++：好+：可接受-：有問題SSOP=SequenceSpecificOligonucleotideProbeSSP=SequenceSpecificPrimer

RFLP=RestrictionFragmentLengthPolymorphism臨床意義HLA配型是移植成功與否最基礎最關鍵的一步，保證供受體間上述分型相同，防止移植排斥反應HLA位點和堿基順序：

位點不同——急性排斥 位點同、堿基順序不同——慢性排斥六、PRA的概念及檢測方法※概念：是指群體反應性抗HLA各種抗原的抗體，通常為IgG；是各種組織器官移植術前篩選致敏受者的重要指標，與移植排斥反應和存活率密切相關。 如果患者在輸血或器官移植中曾經接觸過他人HLA，則會產生較強的抗性，不利于器官移植配型。

群體反應性抗體

panelreactiveantibody,PRAPRA與移植PRA陽性也與心臟移植、肺移植、肝移植中的排斥反應相關，并且往往出現在排斥癥狀發(fā)生之前。受者術前、術后PRA分析可以讓臨床醫(yī)生及時了解移植后的免疫狀態(tài)和具有排斥反應預警作用。2000年美國聯(lián)邦立法將PRA列入器官移植規(guī)范技術，2004年PRA被例入中國的器官移植技術標準之一。抗體特異性

HLA-I類465例（43.5%）

HLA-II類268例(25.1%)HLA-I&-II333例(31.4%)。南方醫(yī)院肖露露

1066例PRA陽性受者的HLA特異性分析

結果和討論HLA-I類抗體比例為75%，最常見的為抗HLA-A2、A24、A19和抗HLA-B40、B15、B22。II類抗體57％；最常見的為抗HLA-DR5，DR4和DR7。

PRA陽性率有顯著地性別差異，女性受者因既往的妊娠經歷導致產生HLA抗體的幾率高。某個特異性HLA抗體的產生的幾率主要受２種因素的影響：（一）該抗原在人群中分布頻率（二）該抗原的等位基因數目

唯一有效的檢測器官移植受者免疫狀態(tài)的方法是體液免疫檢測（而不是細胞免疫檢測），即通過PRA檢查患者HLA抗體的存在。移植前PRA陽性，代表受者已經被致敏，其移植物的存活率明顯低于移植前未被致敏得受者；移植后PRA陽性，則有2種可能：即排斥預兆，或是術中輸血致敏；前者直接介導移植物被排斥，而后者則對移植物無損害。Allo-antibodydetectionwithpurifiedantigen抗原ELISAFLOWLuminexAgAgAgAgColoredBeadsAgAgAgAgAgAgAgAgFITC-Anti-HumanIgG

Anti-Ag(純化抗原的抗體檢測)ELISA：包被HLA抗原LABScan?100Luminex儀器直徑5.6M，液態(tài)反應體系中呈懸浮狀態(tài)表面帶有大量的活性基團，可與核酸探針，抗體等方便地偶聯(lián)MicroPlex微球Microspheres(Beads)Luminex技術的原理Microspheres(Beads)微球在生產過程中帶上紅色和紅外兩種染料兩種染料的不同配比賦予了微球不同的光譜學指紋既特有的熒光激發(fā)光譜.Luminex技術的原理108

Luminex系統(tǒng)可用于各種免疫學實驗,酶學實驗和復雜的基因分析.實驗的反應物,如:抗體、寡核甘酸等被包被到這種特殊的熒光磁珠表面.Luminex技術的原理用捕捉物(一抗)包被微球加進樣品(抗原)加進生物素接合(Biotinylated)的二抗加進報告用的熒光報告基團

AssayLuminex技術的原理紅激光分辨微球本身的光譜學指紋綠激光檢測熒光報告基團AnalysisLuminex技術的原理Luminex技術的特點高通量：1次檢測，僅需10μl樣本，最多可達100個指標高速度：最快可達10000測試/小時低成本：流式熒光技術聯(lián)檢的試劑用量少，能有效降低臨床應用的成本靈敏度高：包被有大量的抗原、抗體或核酸分子，反應充分、產生信號強，通過激光激發(fā)熒光檢測重復性好：每個指標有5000個反應單元，分析100次取均值

PE-anti-IgGAlloantibodyPE-第二抗體結合物檢測HLA抗體工作原理LABScreen7μl血清+14ulPBS(1x)2μl微球室溫下避光孵育30分鐘洗滌3次加入PE-標記第二抗體室溫下避光孵育30分鐘洗滌2次LabScan?100流式分析儀讀取結果操作流程LABScreen特點與優(yōu)勢靈敏度高單管，單次檢測-可同時檢測I類II類PRA特異性強，可達到高分辨水平自動讀取數據，進行分析。操作簡便、快速。高通量處理樣品。LABScreen臨床意義：判斷受者血清是否存在PRA及其致敏程度。移植術前后的PRA高低與術后急性排斥反應明顯有關。

116交叉配型試驗

目的：檢測受者體內是否存在抗供者的特異性抗體以及受者對供者HLA抗原的相容程度。技術要點：供者淋巴細胞+受者血清（混合）供者淋巴細胞+受者淋巴細胞等方法：1、微量細胞毒試驗，2、流式細胞術，

3、混合淋巴細胞培養(yǎng)

供者抗原供者淋巴細胞患者血清(抗供者抗體)補體細胞溶解Micro-lymphocytotoxicitytestComplement-dependentCytotoxicity(CDC)Cross-matchassay(交叉配型)補體依賴的細胞毒試驗(CDC)原理：供者淋巴細胞受者血清補體臨床意義：判斷受者血清是否存在供者抗原的抗體，該抗體可引起超急性排斥反應。0-10%11-20%21-50%51-80%81-100%1陰性2可疑陰性

4弱陽性6陽性

8強陽性CDC試驗結果判定標準

選分數最低的供體

七、移植后需要做哪些檢查移植器官功能監(jiān)測移植排斥反應監(jiān)測免疫抑制藥物監(jiān)測移植術后感染檢測移植器官功能監(jiān)測臨床癥狀實驗室指標影像學指標病理情況肝移植：轉氨酶代謝狀態(tài)凝血因子膽汁一般檢查腎移植：血清肌酐胱抑素C

尿量尿蛋白一般檢查骨髓移植：血細胞骨髓嵌合情況一般檢查移植排斥反應監(jiān)測T淋巴細胞及其亞群檢測

CD3+T細胞

CD4+T細胞

CD8+T細胞

CD4/CD8：

>1.2提示急性排斥

<1.08提示感染移植排斥反應監(jiān)測PRA檢測細胞因子檢測免疫抑制藥物監(jiān)測環(huán)孢素（CsA）阻止數種早期T細胞激活基因的轉錄，抑制巨噬細胞產生白介素Ⅰ。他克莫司（FK506）阻止受異常刺激的T細胞白介素2表達。嗎替麥考酚酯（MMF）藥代相關酶基因多態(tài)性CYP3A5:A/A快代

A/G中代G/G慢代移植術后感染檢測術后1月：多為細菌和真菌術后2-6月：多為病毒查病毒：CMV、HSV、VZV等查細菌：主要是革蘭氏陰性菌查真菌：念珠菌、曲霉菌等巨細胞病毒（CMV）

巨細胞病毒是一種DNA病毒，是新生兒包涵體病（CID）的病原體，其直徑約200nm，為最大的動物病毒。人類巨細胞病毒感染非常普遍，初次感染大多在2歲以下，通常呈隱性感染，少數有臨床癥狀，69~90%成人已有CMV抗體。多數人在兒童時期感染過而產生獲得免疫力，但多數可長期帶毒成為潛伏感染。DirectDetection1DNA/mRNA2pp65Antigenemia

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