實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

關(guān)于實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第1頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三實驗?zāi)康?1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作2.進行大腸桿菌的分離,用固體平板培養(yǎng)基進行細菌的劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理第2頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識：

(一)微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．第3頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三(二)細菌1、結(jié)構(gòu)2、分裂3、生殖4、變異類型5、在基因工程中的應(yīng)用第4頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三細菌的類型圖1-1常見的三種細菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌第5頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三大腸桿菌屬于桿狀菌第6頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌細菌的營養(yǎng)類型光能自養(yǎng)型:光合細菌化能自養(yǎng)型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌第7頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三細菌的革蘭氏染色革蘭氏染色法是一種用于細菌的染色法。此法將細菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細胞壁的成分不同。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌第8頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三-------培養(yǎng)基

1.定義培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。(三)細菌的培養(yǎng)2.培養(yǎng)基的五大營養(yǎng)成分：水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、氧氣、滲透壓的要求．第9頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方：細菌喜葷，霉菌喜素大腸桿菌的配方：酵母提取物

0.5g蛋白胨

0.5gNacl

0.5g

瓊脂

1g水50ml第10頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三3.培養(yǎng)基的類型按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。成分區(qū)別：是否加瓊脂按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：擴增細菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），鑒定、保藏菌種第11頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三選擇培養(yǎng)基:從微生物群中選擇具有特定表型的細胞.使之進行繁殖所用的培養(yǎng)基,稱為選擇培養(yǎng)基.

加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物

第12頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。4、

菌落

第13頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第14頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三二、

無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。第15頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三（１）消毒定義：2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌的定義：是指殺滅病原微生物的方法。

是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括芽孢、孢子）的方法第16頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三a.煮沸消毒法:

100℃煮沸5-6minb.巴氏消毒法：

70-75℃下煮30min或80℃下煮15minc.化學(xué)藥劑消毒法:

用75%酒精進行皮膚消毒;氯氣消毒水源；高錳酸鉀溶液；次氯酸鈉溶液等……（3）常用消毒的方法：第17頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三a、灼燒滅菌常用滅菌的方法：第18頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三b、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。c、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15min.第19頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考1第20頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三二、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗操作（一）培養(yǎng)基的配置與滅菌取2個250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細菌的擴大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細菌的劃線分離封口膜：既通氣又不使雜菌進入第21頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三（二）倒平板滅菌后的培養(yǎng)基在無菌超凈臺上倒入4個培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面。第22頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三注意事項：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌超凈臺用紫外燈和過濾風滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.第23頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三（三）大腸桿菌的擴大培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床上振蕩培養(yǎng)12小時。注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.第24頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三1、劃線分離法在無菌操作臺上用接種環(huán)取菌種后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線.（四）大腸桿菌的分離第25頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三第26頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。第27頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。第28頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三第29頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三注意事項:1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基的不同位置連續(xù)劃線多次。每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌。2.劃線首尾不能相接。3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h第30頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三分離后,一個菌體便會形成一個菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一。第31頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。第32頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第33頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三（五）大腸桿菌分離后保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法第34頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.第35頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三第36頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三劃線分離法和涂布分離法哪個更好呢？劃線分離：方法簡單，但單菌落較難分開。涂布分離：單菌落更易分開，但操作復(fù)雜。第37頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度第38頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標。（3）上述方法較難區(qū)別同類的不同物種，需借助化學(xué)和進一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。第39頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三3.進行恒溫培養(yǎng)時為什么要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會導(dǎo)致菌隨水擴散，很難再分成單菌落，達不到分離目的。第40頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三4.實驗完成后,接種過細菌的器皿應(yīng)如何處理?所有接觸過菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養(yǎng)基）；使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄第41頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三5.如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌,如何保證不被普通的大腸桿菌所污染?轉(zhuǎn)基因用的質(zhì)粒不是細菌中原有的，而是經(jīng)過改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基對菌體進行培養(yǎng)。第42頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三【課堂練習】例1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（）

A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的無機物只提供無機鹽

D.無機氮源也能提供能量D第43頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是（）A.防止雜菌污染B.接種前菌種要進行滅菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前B第44頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三編號成分含量①粉