基因工程疫苗

關(guān)于基因工程疫苗第1頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三2疫苗與基因工程疫苗

傳統(tǒng)疫苗（TraditionalVaccine）用人工變異或從自然界篩選獲得的減毒或無毒的活的病原微生物制成的制劑或者用理化方法將病原微生物殺死制備的生物制劑，用于人工自動免疫以保護人或動物產(chǎn)生免疫力，這些制劑被稱為疫苗（多用于預(yù)防），即疫苗是由病原體制成的。第2頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三3國內(nèi)常將細菌制作的人工主動免疫生物制品稱為菌苗。將病毒（Virus）、立克次氏體（Rickettia）、螺旋體（Spiralcoil）等微生物制成的生物制品稱為疫苗?，F(xiàn)在國際上一般將細菌性制劑、病毒性制劑以及類毒素統(tǒng)稱為疫苗（vaccine）。第3頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三4基因工程疫苗：上述狹義的疫苗被稱做傳統(tǒng)疫苗（traditionalvaccine），即完整的病原體為主制成的疫苗；而基因工程疫苗則屬于新一代疫苗（NewgenerationVaccine）或高技術(shù)疫苗范疇（High-techVaccine）。主要包括基因工程亞單位疫苗、基因工程載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等等，廣義的還包括遺傳重組疫苗、合成肽疫苗、抗獨特型抗體疫苗以及微膠囊可控緩釋疫苗等。第4頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三5現(xiàn)代疫苗（Modernvaccine）：是一種利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)使用Ag通過誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)以予防和治療疾病或達到某種特定的醫(yī)學(xué)目的生物制劑。

第5頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三61、理想疫苗的條件高度有效、絕對安全、產(chǎn)生免疫快、適用于各種人群、可大量生產(chǎn)、方便貯存和運輸、價格合理。2、基因工程疫苗研制的特點相對于傳統(tǒng)疫苗而言，基因工程疫苗的研制需要明確病原體的保護性抗原；基因工程疫苗的構(gòu)建需要特定的載體與表達系統(tǒng)，載體與表達系統(tǒng)既要能夠高效表達外源基因，又要保證基因工程疫苗的安全性。在基因工程疫苗的研制中，保護性抗原（基因）的選擇、載體與表達系統(tǒng)的選擇是關(guān)鍵性因素。佐劑的選擇、免疫途徑、免疫部位、免疫時間及次數(shù)的選擇，也是保證疫苗效力的必不可少的環(huán)節(jié)。第6頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三7一、基因工程亞單位疫苗(geneengineeringsubunitvaccine)1、概述基因工程亞單位疫苗，主要是指將基因工程表達的蛋白抗原純化后制成的疫苗。優(yōu)點：①產(chǎn)量高；②純度高；③安全性高；④用于病原體難于培養(yǎng)或有潛在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。第7頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三8缺點：與傳統(tǒng)亞單位疫苗相比，免疫效果較差。增強其免疫原性的方法：①調(diào)整基因組合使之表達成顆粒性結(jié)構(gòu)②是在體外加以聚團化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球③加入有免疫增強作用的化合物作為佐劑（adjuvant）。

第8頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三92、基因工程亞單位疫苗的設(shè)計策略2.1抗原的選擇保護性抗原成分的選擇是疫苗設(shè)計中最為關(guān)鍵的步驟。有效的保護性抗原需滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：有效的保護性抗原為病原體中具有免疫優(yōu)勢的抗原決定簇，能夠有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對該抗原的抗體，為機體防御病原體的入侵提供保護。對人體是安全的。適量進入人體，不會致病。特異性，針對某一病毒或其它病原體。第9頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三102、基因工程亞單位疫苗的設(shè)計策略保護性抗原的選擇：

一般選擇病原體的結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原構(gòu)建疫苗，對于易變的病毒如A型流感病毒，可選擇各亞型共有的核心蛋白保守區(qū)段作為保護性抗原構(gòu)建疫苗。這樣可以產(chǎn)生跨株系的保護反應(yīng)，避免易變病毒的免疫逃避問題。

一些非結(jié)構(gòu)蛋白也可以作為抗原構(gòu)建疫苗，如乙型腦炎病毒的NS1蛋白也有保護作用。第10頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三112、基因工程亞單位疫苗的設(shè)計策略2.2表達載體及表達系統(tǒng)的選擇表達載體：質(zhì)粒——大腸桿菌及酵母（表達宿主）腺病毒載體、痘苗載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體——哺乳動物細胞第11頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三12二、基因工程載體疫苗（geneengineeringvectorvaccine）1、概述基因工程載體疫苗是指利用微生物做載體，將保護性抗原基因重組到微生物體中，使用能表達保護性抗原基因的重組微生物制成的疫苗。優(yōu)點：疫苗多為活疫苗，重組體用量少，抗原不需純化，載體本身可發(fā)揮佐劑效應(yīng)增強免疫效果缺點：曾感染過腺病毒或者接種過痘苗的人，對載體微生物已具有免疫力，使之接種后不易繁殖，因而影響免疫效果。第12頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三132、基因工程載體疫苗的設(shè)計策略2.1抗原的選擇2.2載體的選擇基因工程載體疫苗的作用機制是將編碼保護性抗原的基因直接在體內(nèi)表達，產(chǎn)生抗原，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。非致病的細菌或病毒都可以作為疫苗載體。載體的安全性是需要考慮的首要問題。原因：A.載體活疫苗不可避免地帶有活病毒或細菌一些潛在的問題。如病毒可能在體內(nèi)不斷地復(fù)制其基因組并形成完整的病毒粒，在繁殖過程中有可能發(fā)生突變、自身修復(fù)、或于野生型毒株重組而發(fā)生毒力返祖，對機體構(gòu)成威脅。第13頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三142、基因工程載體疫苗的設(shè)計策略B.新近形成的病毒粒可由機體排至體外，對環(huán)境造成污染，如人類已經(jīng)不再接種痘苗病毒預(yù)防天花，因此使用痘苗病毒有潛在的危險。

對策：非復(fù)制型病毒。這種載體在轉(zhuǎn)染細胞后僅能形成一代病毒顆粒即自行消滅，由于傳代少，發(fā)生毒力返祖的可能性降低，并且子代數(shù)目少，對環(huán)境的污染程度降低，因此可以大大提高疫苗的安全性。缺點：在體內(nèi)存在時間短，僅能形成一代病毒顆粒，因此保護性抗原拷貝數(shù)低，故免疫效果受到影響，需多次接種。第14頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三152、基因工程載體疫苗的設(shè)計策略常用載體：（1）病毒載體最常用的是痘苗病毒和腺病毒。痘病毒優(yōu)點：宿主范圍廣，可容納大分子外源基因，高水平表達缺點：不能采用口服免疫途徑，因此不能形成黏膜免疫。腺病毒優(yōu)點：可經(jīng)黏膜免疫的理想載體系統(tǒng)

第15頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三162、基因工程載體疫苗的設(shè)計策略常用載體：（2）細菌載體

優(yōu)點：免疫全面，可誘發(fā)黏膜、細胞、體液免疫操作簡單，易于實現(xiàn)多種抗原的輸送。缺點：使用原核系統(tǒng)表達抗原，免疫原性可能受到影響。傷寒沙門氏菌是一種腸道致病菌，其減毒菌株可用于疫苗載體，能誘導(dǎo)黏膜免疫。減毒傷寒沙門氏菌Ty21a缺失了galE基因，細菌表面的Vi抗原為陰性，而且重要抗原——脂多糖的合成能力下降，為減毒菌株。缺點：質(zhì)粒不穩(wěn)定，外源蛋白易降解。第16頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三172、基因工程載體疫苗的設(shè)計策略常用載體：（2）細菌載體

卡介苗（BCG）經(jīng)過半個多世紀(jì)的實踐證明是一種安全疫苗，以誘導(dǎo)細胞免疫為主。缺點：卡介苗在接種者體內(nèi)可誘導(dǎo)很強的針對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致卡介苗被接種者免疫系統(tǒng)破壞，在體內(nèi)存在時間短；外源基因的抗原性較弱。

第17頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三18CellSurfaceDisplayofHighlyPathogenicAvianInfluenzaVirusHemagglutininontheSurfaceofPichiapastorisCellsUsinga-AgglutininforProductionofOralVaccines

Expressionofproteinsinyeastisfast,inexpensive,andyeasthavetheaddedbenefitofprovidinghigh-qualitynutritionwhengiveninthefeed.Yeastaregenerallyregardedassafeandbenignorganismsandwouldthereforeallowlong-termfeedingofyeastexpressingrecombinantproteinsinordertomaintainimmunityovertimewithlimitedsideeffects.Inadditiontotheconvenienceofproduction,componentsoftheyeastcellwallhavebeenshowntocontainnaturaladjuvantactivity.Therefore,theexpressedrecombinantproteinsaremoreimmunogenicwhenadministeredwiththeyeastcellwallcomponents.第18頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三19AGa1,甘露糖蛋白а凝集素

第19頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三20第20頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三21第21頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三22第22頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三23三、基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）1、概述基因缺失活疫苗使用分子生物學(xué)技術(shù)改造或去除與毒力有關(guān)株的基因，獲得穩(wěn)定的減毒表型的缺失突變毒株，用該突變制成的疫苗即為基因缺失活疫苗。優(yōu)點：①有突變性狀明確、穩(wěn)定；②不易返祖、毒力恢復(fù)；③是研究安全有效的新型疫苗的重要途徑。第23頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三242、基因缺失活疫苗的設(shè)計策略

設(shè)計關(guān)鍵：選擇合適的靶基因。一般選擇刪除與毒力有關(guān)，病原微生物復(fù)制的非必需基因。為了減少發(fā)生毒力返祖的可能性，最為理想的是刪除至少兩個與毒力相關(guān)的基因或基因作用位點。必須建立在對病毒的毒力相關(guān)基因有清楚的了解基礎(chǔ)之上。目前，對病原體的基因組測序工作開展較多，為基因缺失活疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。第24頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三25

核酸疫苗（nucleotidevaccine）：又稱DNA疫苗（DNAvaccine），是將一種或多種目的抗原的編碼基因克隆到真核質(zhì)粒表達載體上；再將重組質(zhì)粒直接注入到體內(nèi)，在宿主細胞內(nèi)表達目的蛋白，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。

四、核酸疫苗第25頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三26

1990年，Wolff等首次發(fā)現(xiàn)，給小鼠肌肉注射裸露質(zhì)粒DNA后，質(zhì)粒攜帶的基因可被肌細胞攝取并在其中表達，還可誘生特異性免疫應(yīng)答。

四、核酸疫苗第26頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三27優(yōu)點：①易于制備；②便于保存；③可多次免疫并且容易制成多聯(lián)多價疫苗。缺點：①外源核酸是否會整合到染色體中引起癌變；②能否引起免疫病理作用，如自身抗核酸抗體的產(chǎn)生，免疫耐受等。第27頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三28

目前進入臨床試驗的核酸疫苗有HIVDNA疫苗和瘧疾DNA疫苗。四、核酸疫苗第28頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三29

由于核酸疫苗具有構(gòu)建容易、生產(chǎn)方便、表達穩(wěn)定及可誘發(fā)全面的免疫應(yīng)答等特點，在抗感染、抗腫瘤免疫及疾病的預(yù)防等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，被譽為疫苗的“第三次革命”。

四、核酸疫苗第29頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三30

局部注射的核酸（重組質(zhì)粒DNA）被周圍的細胞（如黏膜上皮細胞、抗原提呈細胞）攝取后，進入核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄，并在胞質(zhì)中翻譯成目的蛋白。1、免疫機制四、核酸疫苗第30頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三31

目的蛋白被蛋白酶復(fù)合體降解成含有表位的抗原肽，可作為：

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“內(nèi)源性抗原”：與MHCⅠ類分子結(jié)合，誘發(fā)CTL介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答。

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“外源性抗原”：與MHCⅡ類分子結(jié)合，誘發(fā)偏向Th1型免疫應(yīng)答。四、核酸疫苗第31頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三32

目的蛋白亦可通過細胞分泌或細胞破裂的方式進入組織間，以天然折疊形式激活B淋巴細胞而產(chǎn)生抗體。四、核酸疫苗第32頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三33

DNA疫苗接種后，體內(nèi)僅表達pg～ng水平的外源蛋白，但能誘發(fā)強而持久的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答。

如何解釋這一現(xiàn)象呢？

四、核酸疫苗第33頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三34

目的基因（含載體質(zhì)粒）含有CpG基序的回文序列，能激活較強的CTL效應(yīng)，并能激活巨噬細胞與NK細胞，因此，CpG回文序列被稱為免疫刺激DNA序列。

CpG基序與IL-2、TNF-β、IFN-γ的基因結(jié)構(gòu)相似而產(chǎn)生協(xié)同作用。

四、核酸疫苗第34頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三352、構(gòu)建與免疫

①目的基因的選擇：側(cè)重于免疫原性，即所表達的目的蛋白刺激機體免疫應(yīng)答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T細胞抗原表位，是保證核酸免疫有效的先決條件。

四、核酸疫苗第35頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三36

核酸疫苗所選擇的目的基因應(yīng)盡量避免有害基因成分，特別是病毒或腫瘤的核酸免疫。四、核酸疫苗第36頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三37

②載體的選擇：構(gòu)建DNA疫苗的質(zhì)粒通常是非復(fù)制型的真核表達質(zhì)粒，能高水平地表達目的基因。

四、核酸疫苗第37頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三38

重組質(zhì)?？煞譃閮蓚€部分：

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轉(zhuǎn)錄部分：由啟動子、插入的目的抗原cDNA和polyA終止子組成，指導(dǎo)目的蛋白在體內(nèi)表達，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。

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佐劑部分：CpG基序。四、核酸疫苗第38頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三39

③啟動子的選擇：質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)表達外源性蛋白的水平與調(diào)控DNA表達的啟動子關(guān)系密切。表達水平的不同又直接影響免疫應(yīng)答的強度和持續(xù)性。

四、核酸疫苗第39頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三40

④DNA疫苗的優(yōu)化

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聯(lián)合構(gòu)建：在載體質(zhì)粒中插入2個或2個以上目的抗原基因，既能激活CD8＋T細胞產(chǎn)生特異性CTL，又能激活CD4＋Th2細胞產(chǎn)生體液免疫。

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協(xié)同構(gòu)建：將目的基因與某種細胞因子的基因構(gòu)建成嵌合基因，以促進目的基因的免疫效果。

四、核酸疫苗第40頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三41

⑤免疫途徑、劑量、時間：常見免疫途徑有肌肉注射、皮內(nèi)或皮下免疫、粘膜免疫等。

四、核酸疫苗第41頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三423、核酸疫苗與傳統(tǒng)疫苗的比較

傳統(tǒng)免疫所使用的抗原一般是滅活病原體、減毒的活病原體或病原體的亞單位蛋白。

核酸疫苗僅僅是病原體某種抗原的基因片段，可提供與天然構(gòu)象極為接近的目的蛋白，提呈給宿主免疫系統(tǒng)，與自然感染過程相似。

四、核酸疫苗第42頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三43

核酸疫苗兼有重組亞單位疫苗的安全性和減毒活疫苗誘導(dǎo)全方位免疫應(yīng)答的高效力。四、核酸疫苗第43頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三44

滅活疫苗和亞單位疫苗在體內(nèi)代謝較快，難以長時間維持較穩(wěn)定的含量，需多次接種免疫原，加強免疫。

核酸疫苗可在體內(nèi)不斷翻譯表達，較長時間維持較高的蛋白水平，免疫具有連續(xù)性，一次接種可獲得長期或終身免疫力。

四、核酸疫苗第44頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三45

采用不同毒株之間的保守DNA序列作核酸疫苗，可使其免疫作用突破地理株的限制，從而有效地預(yù)防病原體極易發(fā)生變異的某些疾?。ㄈ绫透窝?、甲型流感、艾滋病等）。

四、核酸疫苗第45頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三46

核酸疫苗與世界衛(wèi)生組織兒童計劃免疫長遠目標(biāo)（用一種疫苗預(yù)防多種疾?。┫辔呛?，不僅能預(yù)防疾病，還可作為治療性疫苗，治療一些復(fù)雜難治的疾病，如病毒性肝炎、癌癥等。四、核酸疫苗第46頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三47五、蛋白工程疫苗（proteinenginee