腫瘤病理生物學(xué)-腫瘤的分子病理診斷技術(shù)

腫瘤的分子病理診斷技術(shù)

2017-9-15

第一節(jié)細(xì)胞與分子診斷在

腫瘤研究中的應(yīng)用和意義

一、腫瘤易感基因的檢測研究發(fā)現(xiàn)部分腫瘤的發(fā)生具有分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，腫瘤易感基因的檢測對腫瘤高危人群的篩選具有實用價值。主要的腫瘤易感基因包括：腫瘤易感基因Rb1(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因）WT1(腎母細(xì)胞瘤基因）P53(Li-Fraumeni綜合征)APC(家族性腺瘤性息肉病)Rb1(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因）WT1(腎母細(xì)胞瘤基因）P53(Li-Fraumeni綜合征)APC(家族性腺瘤性息肉病)

二、腫瘤的分類腫瘤克隆起源和異質(zhì)性還存在諸多未知機(jī)理，目前使用的腫瘤分類、分型標(biāo)準(zhǔn)還無法反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)行為特點，包括診斷、預(yù)后等生物學(xué)指標(biāo)。

三、腫瘤的早期診斷蛋白質(zhì)水平腫瘤相關(guān)抗原和胚胎抗原(如AFP、CEA等)分子水平基因擴(kuò)增、等位基因缺失、基因突變、甲基化等

腫瘤的早期診斷目前尚缺乏敏感性高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡易的篩檢靶點和手段，但在分子水平上尋找早期診斷的靶點是努力的方向。各種腫瘤發(fā)生發(fā)展分子模型的建立將有助于這一領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

四、腫瘤的預(yù)后判斷和監(jiān)測

在分子水平上為腫瘤預(yù)后判斷提供指標(biāo)已進(jìn)行了很多有價值的研究，其中癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因、細(xì)胞外粘附分子等的狀態(tài),可為腫瘤預(yù)后提供參考指標(biāo)

五、腫瘤的個體化和靶向治療

在分子水平上檢測腫瘤基因的變化,提出對腫瘤的個體化和預(yù)見性治療意見。

如

癌基因的檢測基因突變的檢測基因甲基化狀態(tài)的檢測

第二節(jié)腫瘤基因過表達(dá)及其檢測方法

基因過表達(dá)的形式癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤基因異常的主要形式。基因過表達(dá)可表現(xiàn)為翻譯(蛋白質(zhì))、轉(zhuǎn)錄(RNA)和基因拷貝數(shù)(DNA)增加三個水平。

一、基因過表達(dá)的檢測

蛋白產(chǎn)物的檢測酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術(shù)蛋白免疫印漬(Westernblot)技術(shù)免疫組織化學(xué)(IHC)檢測技術(shù)流式細(xì)胞儀

反義正義正義反義pcDNA3pcDNA3wpt53pcDNA3wtp53pcDNA3pcDNA3wpt53pcDNA3wtp53

轉(zhuǎn)染正義和反義野生型p53后SMMC-7721細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞的p53

蛋白的表達(dá)

SMMC-7721細(xì)胞Hep3B細(xì)胞

1pcDNA32pcDNA3HBx3pcDNA3HBx3-40

123?-actin

?-actin

?-actin

PCDNA3-p33ING1b

和wt-p53

PCDNA3-p33ING1b

PCDNA3-αp33ING1b

PCDNA3

流式細(xì)胞儀技術(shù)二、免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)

免疫熒光間接法EnVision法(多聚物)

S-P法/LSAB法(親和細(xì)胞化學(xué))

CSA法PAP法圖(A-F)為免疫組化各種方法結(jié)果圖：A-B為免疫熒光直接法,接間法;C.IGSS法-P53;D為S-P法肺腫瘤組織中的EGFR;E為CSA法-CD44v6;F為EnVision法-HPC陽性

三、原位雜交檢測技術(shù)

原位雜交(ISH)是指應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織細(xì)胞中待測的核酸按堿基配對的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體,用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法，在核酸原的位上把它顯示出來。

核酸探針根據(jù)標(biāo)記物

根據(jù)探針的核酸性質(zhì)核酸探針的分類DNA探針鎖核酸探針RNA探針cDNA探針cRNA探針寡核苷酸探針放射性探針

非放射性探針探針種類優(yōu)點缺點cDNA1、制備簡單2、放射比活性高3、信號特異性強(qiáng)4、雜交體較穩(wěn)定1、變性后才能使用2、要通過基因克隆制備3、組織穿透力差4、易于退火，敏感性稍差cRNA1、信號特異性強(qiáng)2、不需變性3、雜交后可用RNase除去未雜交探針因而信噪比高4、雜交體非常穩(wěn)定5、不會退火1、易被RNase降解2、易吸附于器皿上3、組織穿透力差4、需做亞克隆5、模板需線性化寡聚核苷酸1、易制備2、使用方便3、組織穿透力強(qiáng)4、不需做克隆5、不會退火6、只要知道氨基酸順序便可制備探針1、需核酸合成儀2、需明確mRNA順序3、單堿基錯誤將影響雜交4、雜交體不太穩(wěn)定5、信/噪比偏低6、需做多種對照cDNA、cRNA和寡聚核苷酸探針的優(yōu)缺點比較

原位雜交目標(biāo)

DNA—DNAcDNA—RNA，

RNA—RNA

寡核苷酸—DNA或RNAmiRNA

雜交對象

組織

活細(xì)胞

細(xì)胞學(xué)石蠟切片冰凍切片爬片收集細(xì)胞涂片

雜交形式漂浮法貼片法

原位雜交技術(shù)類型原位雜交-ISH

-FISH:單色FISH和雙色FISH

-CISH:單色CISH和雙色CISH

-GOLDFISH

-同位素標(biāo)記原位雜交RNAscope技術(shù)LSIHER-2和CEP17

FISH原位雜交檢測乳腺癌腫瘤細(xì)胞中的HER-2基因的擴(kuò)增，包括基因片段的擴(kuò)增和染色體倍數(shù)的擴(kuò)增

發(fā)色原位雜交(ChromogenicinSituHybridization;CISH)技術(shù)是將免疫組化的顯色反應(yīng)與原位雜交技術(shù)相結(jié)合,原位檢測特異性DNA片段或染色體移位或染色體畸變

CISH技術(shù)CISH高拷貝擴(kuò)增：大于50%的腫瘤細(xì)胞核內(nèi)有多于10個信號點或者凝結(jié)成團(tuán)塊狀、簇狀信號顆粒雙色銀染原位雜交(DSISH)

Her2/CEN17EGFR/CEN7銀染原位雜交:靶向DNADNP標(biāo)記的HER2探針or17號染色體探針兔抗2，4二硝基苯酚（DNP）單抗HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗多聚體SISHChromogens:A=醋酸銀B=對苯二酚C=過氧化氫ABCMETALDEPOSITION

Silverisprecipitatedwhensilverions(A)arereducedtoMetallicsilveratomsbyHydroquinone(B).ThisreactionisfueledbythesubstrateforHRP,hydrogenperoxide(C).60X腫瘤細(xì)胞組織異質(zhì)性。綠色箭頭顯示

HER2簇裝擴(kuò)增；橙色箭頭顯示

HER2

非擴(kuò)增。ISH雙色銀染原位雜交HER2

非擴(kuò)增●HER2●CEN17HER2

擴(kuò)增60X組織異質(zhì)性。綠色箭頭顯示

HER2簇裝擴(kuò)增；橙色箭頭顯示

HER2

非擴(kuò)增。HER2雙色銀染RNAscope?探針引物設(shè)計

信號放大原理RNAscope原位雜交技術(shù)雙Z形探針設(shè)計級聯(lián)放大檢測RNAscope技術(shù)特點RNAscope?探針引物設(shè)計RNAscope?采用類似于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的設(shè)計原理。兩個獨(dú)立的引物探針(Z形引物對)需要隨機(jī)與目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合，以實現(xiàn)信號放大。兩個獨(dú)立引物相互緊挨同時相互互補(bǔ)結(jié)合到一個非目標(biāo)序列的可能性非常小，這種設(shè)計原理保障了對目標(biāo)信號的特異性放大。對于任意一個目標(biāo)RNA序列，都有一組獨(dú)特設(shè)計的20對Z形引物探針(包含一個18~25個堿基序列與靶RNA堿基互補(bǔ)的區(qū)域)對,只針對該目標(biāo)序列具有互補(bǔ)雜交特異性，而不會結(jié)合到非目標(biāo)片段上。己知靶目標(biāo)必須大于300bp。每一個Z形探針包含三個結(jié)構(gòu)元素:①Z型探針底部是一個18-25左右堿基長度的序列能夠互補(bǔ)結(jié)合到目標(biāo)RNA上。這個序列是基于目標(biāo)序列的不同，以及獨(dú)特的結(jié)合特征而進(jìn)行的特異性設(shè)計。RNAscope?探針特點②Z型探針的中部是一個間隔序列，鏈接了探針的上下兩端。③Z型探針的頂端是一個14堿基長度的尾部序列。因而一對Z形探針對的頂端序列組合成一段28個堿基長度的結(jié)合區(qū)以供信號放大前體序列的結(jié)合。信號放大原理

信號的放大由一系列的雜交組合串聯(lián)事件最終實現(xiàn)⑴20組Z形探針對互補(bǔ)結(jié)合到1KB長度的目標(biāo)RNA上。⑵信號放大前體序列結(jié)合到一對Z形探針頂端拼接而成的28個堿基長度的結(jié)合區(qū)域。⑶信號放大序列進(jìn)一步結(jié)合到信號放大前體序列上的20個互補(bǔ)結(jié)合區(qū)。⑷帶有熒光分子標(biāo)記或者顯色酶標(biāo)記的引物結(jié)合到信號放大序列上的20個互補(bǔ)結(jié)合區(qū)。

RNAscope?技術(shù)的優(yōu)勢⑴靈敏度每三對Z形探針對就足以實現(xiàn)對一個RNA分子的檢測。在RNA分子出現(xiàn)部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情況下，20對Z形探針對的設(shè)計保障了足夠強(qiáng)勁有效的檢測RNA。②特異性Z形探針對的設(shè)計屏蔽了背景噪音。單獨(dú)一個Z形探針對即使結(jié)合上非目標(biāo)序列也無法提供信號放大前體序列結(jié)合所需要的足夠長度，從而防止了對于非特異信號的擴(kuò)增，保障了特異性。

RNAscope?技術(shù)的優(yōu)勢③單分子水平的可視性與量化分析此20x20x20x的引物設(shè)計與信號放大原理讓單一RNA分子能夠在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下以一個點狀信號的方式可視化呈現(xiàn)。④能夠檢測部分降解的RNA得益于其相對短小的目標(biāo)結(jié)合區(qū)域(Z形探針對的底端40~50個堿基長度)，此Z形探針對的設(shè)計為檢測到部分降解的RNA提供了保障。RNAscope原位雜交操作流程步驟1常規(guī)固定的細(xì)胞或組織石蠟切片;步驟2靶RNA的特異性寡核苷酸探針（Z）對（ZZ）多種RNA目標(biāo)進(jìn)行雜交;步驟3多個信號放大分子被雜交，每個識別特定的目標(biāo)探針，每一個獨(dú)特的標(biāo)記探針結(jié)合不同的熒光或酶;步驟4顯微鏡觀察結(jié)果。操作流程---標(biāo)準(zhǔn)版

1.透化：通過RNAscope?預(yù)處理試劑盒處理載玻片上固定好的組織或細(xì)胞，以暴露目標(biāo)RNA。

2.雜交：RNAscope?的20對針對靶基因設(shè)計的Z型目標(biāo)探針與目標(biāo)RNA雜交。

3.信號放大：RNAscope?檢測試劑盒通過信號擴(kuò)增序列與顯色標(biāo)記有序地互補(bǔ)結(jié)合從而擴(kuò)大信號。

4.可視信號形成：在透視光學(xué)顯微鏡或者多光譜成像系統(tǒng)的觀測下，每一個目標(biāo)RNA分子以一個點狀信號的形式呈現(xiàn)。

5.量化分析顯微鏡下直接計數(shù)。

原位雜交檢測的優(yōu)點①特異性強(qiáng)，靈敏度高，可有直接法、間接法②具有原位、可見的特點③既可用新鮮組織，又可用石蠟包埋組織④所需樣本量少、細(xì)針穿刺、細(xì)胞涂片均可檢測⑤應(yīng)用范圍廣，定位、定性、定量及亞細(xì)胞定位(雜交電鏡)⑥雙重或多重標(biāo)記ISH檢測技術(shù)的應(yīng)用病毒類:HPV、HBV、HCV、EBER、CMV、HHV8軟組織腫瘤①滑膜肉瘤:t(x;18)(p11;q11)SYT-SSX基因融合。②尤文肉瘤:t(11;22)(q24;q12,)EWS-FLI11融合基因，③橫紋肌肉瘤:涉及FKHR基因的斷裂，④脂肪肉瘤:FUS-CHOP融合基因。ISH檢測技術(shù)的應(yīng)用少突膠質(zhì)瘤:1p/19q雜合性缺失。膀胱癌—CSP3/CSP7;GLPp16/CSP17探針。前列腺癌融合基因探針。宮頸癌—GLPTERC/CSP3探針。慢性粒細(xì)胞性白血病—BCR/ABL融合基因探針等。原癌基因:HER2、EGFR、N-myc。

不同病變TPOmRNA的表達(dá)（1.結(jié)甲;2.橋本氏病;3.腺瘤;4~5.乳頭狀癌;6.濾泡性癌）Marker123456MarkerRT-PCRβ-actin→TPO←2000←1000←500←250←1002.實時定量PCR數(shù)字PCR技術(shù)ddPCR技術(shù)特點及檢測的技術(shù)挑戰(zhàn)突變檢測——從組織到血液SourceofcfDNA--tumornecrosis/apoptosis--tumorexosome/microvesicles

--normaltissueapoptosis--inflammatorycellsTissueBloodctDNA優(yōu)勢指導(dǎo)用藥實時監(jiān)測勻質(zhì)標(biāo)本腫瘤組織的異質(zhì)性可以分為空間上的和時間上的，前者的異質(zhì)性存在于病灶的不同部位，或者原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間，后者的異質(zhì)性存在于腫瘤本身的進(jìn)展與治療的不同階段。

以血液內(nèi)ctDNA為檢測對象的液態(tài)活檢可以很好的解決上述難點。

由于腫瘤異質(zhì)性的特點，病人會隨著抗癌藥物的使用產(chǎn)生耐藥性，二次手術(shù)或者活檢將更加困難。血液檢測作為無法獲取組織標(biāo)本的補(bǔ)充，無創(chuàng)、無損、取樣后的檢測結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥對腫瘤的演化和適性改變進(jìn)行監(jiān)控；能夠?qū)δ[瘤病人的治療效果進(jìn)行實時監(jiān)控（尤其在追蹤腫瘤轉(zhuǎn)歸、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面），并進(jìn)行個性化的治療方案指導(dǎo)（如個性化靶向藥物用藥，個性化化療等）。ctDNA特點總量少–

<500

DNA拷貝數(shù)/200uL血漿片段小–集中在170bp左右FractionofEGFRmutantintotalctDNANumberofEGFRM+plasmasamples61376353activatingmutations,N=32T790M,N=11ctDNA豐度低ctDNA特點決定對檢測技術(shù)的要求High

sensitivity(0.01%-0.1%)AbsolutequantitationDanymicmonitoring突變豐度腫瘤異質(zhì)性TKI耐藥機(jī)制定性到定量、靜態(tài)到動態(tài)檢測趨勢ctDNA檢測技術(shù)

373例初治的患者，298例患者存在T790M突變，比例高達(dá)約80%；突變豐度<1%的患者比例為98%，突變豐度>1%的患者比例僅為2%；目前，ARMS法的靈敏度為1%，無法檢測絕大多數(shù)T790M突變；

ARMS

Digital

PCRMasaruetal,ClinCancerRes(2015)ddPCR技術(shù)是當(dāng)前最靈敏的檢測手段微滴式數(shù)字PCR將一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個反應(yīng)器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。陰性微滴比例推算起始靶分子的絕對量泊松分布一個待分析的PCR反應(yīng)體系成千上萬個獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系:靶標(biāo)分子:有限稀釋●:陽性微滴（1）○:陰性微滴（0）泊松分布PCR擴(kuò)增優(yōu)點：可絕對定量，靈敏度可達(dá)單個核酸分子，檢測限低至0.001%；缺點：只能檢測已知的突變位點，通量低；采用泊松分布推算陽性微滴所占比例一個待分析的PCR反應(yīng)體系成千上萬個獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系:ddPCR檢測流程數(shù)據(jù)分析原理——泊松分布分析軟件根據(jù)每個樣品中陽性微滴/總微滴的數(shù)目計算出靶分子的濃度(copies/uL)現(xiàn)有平臺Bio-rad

微滴式數(shù)字

PCR

ABIQuantStudio3D芯片數(shù)字PCR

12345678←2000←2503.Northernblot4.Southernblot第三節(jié)基因重排檢測方法基因重排檢測的方法主要有兩種

Southernblot雜交法多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)(PCR)FISH方法Southernblot雜交法優(yōu)點

敏感度高，可靠性好，被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”判斷是否為單克隆性細(xì)胞增生判斷腫瘤細(xì)胞的來源檢測腫瘤細(xì)胞的殘留和復(fù)發(fā)缺點

需要較大量的新鮮組織或冰凍組織(10ug)

操作復(fù)雜，時間過長需使用放射性同位素標(biāo)記、易污染，成本高僅適用于科研不適于臨床診斷PCR擴(kuò)增法優(yōu)點

快速、簡便、敏感、經(jīng)濟(jì)實用新鮮、冰凍、石蠟包埋組織和穿刺細(xì)胞標(biāo)本均可避免放射性危害，易于常規(guī)開展目前IgH基因和TCR和基因用的比較成功缺點

影響因素多穩(wěn)定性欠佳影響穩(wěn)定性的因素：樣本DNA質(zhì)量、濃度引物的質(zhì)量、濃度

PCR反應(yīng)體系

DNA聚合酶的活性退火溫度PCR基因重排檢測法

三個基本環(huán)節(jié)

1模板DNA的制備：提取DNA2PCR擴(kuò)增

3PCR產(chǎn)物的鑒定

第四節(jié)基因突變檢測技術(shù)

DNA測序(DNAsequencing)作為一種重要的實驗技術(shù)，在生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。1977年Sanger發(fā)明了具有里程碑意義的末端終止測序法，同年Maxam和Gilbert發(fā)明了化學(xué)降解法。第四節(jié)基因突變檢測技術(shù)PCR-DNA測序法焦磷酸測序法HRM(高分辨熔解曲線)法NGS(下一代基因測序)ARMS法

一、PCR-DNA測序法

確定未知和已知基因突變最直接可靠的方法。雙脫氧鏈終止法是由Sanger等1977年提出。焦磷酸測序法適于對已知的短序列的測序分析,其可重復(fù)性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美,而速度卻大大的提高。

Sanger法原理（雙脫氧鏈末端終止法）在PCR時加入熒光標(biāo)記的復(fù)制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應(yīng)于4種堿基）ddX的兩個作用：可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接電泳誰終止，堿基就是誰

肺癌的EGFR-21第2573堿基T-G突變2573T>G圖一：WildType圖二：Mutation圖一圖二焦磷酸測序焦磷酸測序儀的測序原理主要有四種，即使用合成法測序（SequencingbySynthesis）的454和Solexa，以及使用連接法測序（SequencingbyLigation）的SOLiD和Polonator。該技術(shù)是由波爾·尼倫和穆斯塔法·羅納吉于1996年創(chuàng)立。

HRM和ARMS技術(shù)根據(jù)DNA序列的長度，GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對樣品進(jìn)行分析，其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達(dá)到對單個堿基差異的區(qū)分。

利用了特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況記錄高分辨率熔解曲線，從而對樣品進(jìn)行檢測目前開展的基因突變項目腫瘤名稱靶分子檢測方法大腸癌K-RASB-RAFARMS非小細(xì)胞肺癌EGFREML4-ALKARMS胃腸道間質(zhì)瘤C-KITPDGFRa測序法黑色素瘤B-RAFARMS甲狀腺乳頭狀癌B-RAFARMS病理評估合格的標(biāo)本適用于EGFR基因突變檢測適于突變檢測的標(biāo)本標(biāo)本通常較大，能提供足夠的腫瘤組織用于檢測標(biāo)本可以是冰凍或福爾馬林固定組織手術(shù)標(biāo)本標(biāo)本接收、固定組織處理、石蠟包埋切片及H&E染色組織學(xué)觀察DNA的質(zhì)控

突變檢測流程檢測試劑選用具有SFDA認(rèn)證的試劑應(yīng)建立一套完整的試劑進(jìn)購與質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程應(yīng)在有效期內(nèi)使用，并有試劑接收，貯存和使用記錄。ARMS突變檢測實驗流程Real-timePCR數(shù)據(jù)分析（無需PCR后處理）實驗結(jié)果一目了然配制樣品DNA與Taq酶的混合液分裝混合液至試劑盒中的八聯(lián)管稀釋DNA樣品濃度到2-3ng/ul檢測流程的驗證應(yīng)通過驗證建立檢測所需的最小腫瘤細(xì)胞含量和腫瘤細(xì)胞數(shù)應(yīng)有病理醫(yī)生評估整個腫瘤樣本的內(nèi)容，指導(dǎo)有經(jīng)驗的技術(shù)員進(jìn)行操作，必要時進(jìn)行手工切割進(jìn)行富集

數(shù)據(jù)分析和報告內(nèi)容基因檢測報告患者基本信息基因檢測結(jié)果和結(jié)論檢測方法和試劑被檢標(biāo)本來源，基本病理學(xué)狀態(tài)；標(biāo)本種類；腫瘤細(xì)胞數(shù)量；腫瘤細(xì)胞數(shù)所占比例等DNA的質(zhì)控結(jié)果由病理醫(yī)生/主管技師簽發(fā)！備注：該檢測結(jié)果僅對本次送檢標(biāo)本負(fù)責(zé)IonPGM測序平臺實驗流程步驟時間（h)1DNA/RNA樣本--2文庫準(zhǔn)備3.53測序樣本準(zhǔn)備34

測序反應(yīng)25產(chǎn)出數(shù)據(jù)0.5總計9表1PGM實驗流程減少測序反應(yīng)來源的測序錯誤，保證長讀長序列測序質(zhì)量，避免GCbias對測序質(zhì)量的影響無需堿基修飾無需熒光修飾無需酶促級聯(lián)反應(yīng)ConfidentialandProprietary—DONOTDUPLICATE

SemiconductorSequencingisbasedonsimple,naturalchemistry（后光學(xué)時代測序——基于簡單化學(xué)反應(yīng)的半導(dǎo)體測序)數(shù)據(jù)質(zhì)量不受讀長影響IonPGM?和IonProton?測序原理SensorPlateSiliconSubstrateDrainSourceBulkdNTPTocolumnreceiver?pH?Q?VSensingLayerH+RothbergJ.M.etalNaturedoi:10.1038/nature10242特點:快速直接檢測，無需光學(xué)轉(zhuǎn)換直接檢測氫離子，并將其轉(zhuǎn)換為可由電晶體基片讀取出來的電信號

無需激發(fā)光源和CCD光學(xué)檢測設(shè)備，儀器維護(hù)簡單

節(jié)約拍照及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換時間，測序時間短至1.5hrs82芯片是單次使用耗材，無需后續(xù)維護(hù)通量可擴(kuò)展，不同實驗設(shè)計，可選不同通量芯片，一臺機(jī)子，契合不同需求，實時開機(jī)，無需湊樣本IonTorrent?測序系統(tǒng)芯片就是測序儀PGM單端測序讀長可至400bp，后期可直接擴(kuò)展至~600bp，無需硬件升級314?Chip:1.2Mwells,>10Mb316?Chip:6.1Mwells,>100Mb318?Chip:11Mwells,>1.5GbProton單端測序讀長可至200bp，:后期可直接擴(kuò)展至~400bp，無需硬件升級PI?Chip:165Mwells,15Gb83IonPGM測序平臺實驗流程1.測序文庫的構(gòu)建(IonAmpliseq文庫制備)首先準(zhǔn)備基因組DNA,然后將DNA隨機(jī)片段化(消化)成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭(Adaptor)。如果是轉(zhuǎn)錄組測序，則文庫的構(gòu)建要相對麻煩些，RNA片段化之后需反轉(zhuǎn)成cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，然后再片段化并加上接頭。IonPGM測序平臺實驗流程⑴PCR擴(kuò)增基因組DNA的目標(biāo)區(qū)域IonPGM測序平臺實驗流程⑵部分消化引物序列IonPGM測序平臺實驗流程⑶將接頭連接至擴(kuò)增產(chǎn)物并純化

⑷純化未擴(kuò)增文庫。

⑸文庫定量和稀釋。

⑹儲存文庫4-8℃1月;-20℃更長時間。IonPGM測序平臺實驗流程2.自動模本制備(IonPGM200bp)--適用于IonOneTouchTM2系統(tǒng)

在IonOneTouch2儀器上制備模板ISP。需要做的工作如下:⑴準(zhǔn)備工作主耍儀器:IonOneTouch2。⑵在IonOneTouch2上制備模板ISP。⑶IonOneTouchTMES的操作及陽性模板富集。IonPGM測序平臺實驗流程3.IonPGM200bp讀長上機(jī)測序操作IonPGM測序平臺實驗流程4.Ampliseq數(shù)據(jù)分析流程該分析流程基于IonTorrent信息平臺TorrentSuite(TS)和IonReporter(IR)兩大系統(tǒng),對Ampliseq數(shù)據(jù)進(jìn)行一站式快速分折,包含數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、變異位點檢出,變異位點注釋,以及報告生成等重耍生物信息學(xué)分析步驟。TS系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)測序和數(shù)據(jù)的常規(guī)分析,IR系統(tǒng)主要完成對數(shù)據(jù)的生物學(xué)功能注釋以及對結(jié)果的解讀和生成報告。IonPGM測序平臺實驗流程

NGS應(yīng)用腫瘤相關(guān)的臨床檢測

1.腫瘤風(fēng)險預(yù)估(腫瘤易感基因檢測）早期診斷、分子分型、手術(shù)/放化療(藥物療效評估)、靶向治療用藥靶點檢測、預(yù)后風(fēng)險預(yù)估、預(yù)后監(jiān)測(復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移)和腫瘤相關(guān)臨床檢測特點（需求)。IonAmpliSeq?

BRCA1&BRCA2PanelCustomerperformancewith8samplesonIon316?Chip(average)Meancoverage2,137Minimumcoverage122%amplicons>20%average98.6%amplicons>100X99.81:腫瘤風(fēng)險預(yù)估(1)乳腺癌/卵巢癌易感基因BRCA1/2檢測根據(jù)EuropeanMolecularGeneticsQualityNetwork(EMQN)最佳實踐指南對遺傳性乳腺癌、卵巢癌的分子遺傳分析要求，設(shè)計開發(fā)分析BRCA1和BRCA2基因編碼區(qū)域的突變情況。100%覆蓋所有編碼外顯子以及外顯子與內(nèi)含子的邊界區(qū)域(重疊10~20bp)。167個擴(kuò)增子，適合于多種樣本(如FFPE)，僅需30ng樣本DNA。為什么需要測全部外顯子：歐美人熱點突變≠中國人熱點突變大數(shù)據(jù)時代，數(shù)據(jù)最是最大資源，全外顯子測序提供詳盡基因位點信息93(2)抑癌基因TP53全外顯子檢測覆蓋完整TP53編碼外顯子區(qū)域，使用優(yōu)化引物組，使測序脫靶幾率降至最低適用于FFPE樣本：125-175bp設(shè)計100%覆蓋編碼區(qū)域的設(shè)計314/316/318芯片可處理2/10/20個樣本與其他基因高度同源，實現(xiàn)高脫靶率設(shè)計極具難度,站點中最常申請的基因之一IonAmpliSeq?TP53

Panel94應(yīng)用2:腫瘤分子分型/靶向用藥指導(dǎo)BreastCancerCervicalCancerColorectalCancerLiverCancerLungCancerOvarianCancerPancreaticCancerProstateCancerSkinCancerStomachCancerThyroidCancerALKAKT1BRAFEGFRERBB2KRASNRASMAP2K1PIK3CARETROS1UndefinedFromanatomicaltomolecularapproach腫瘤的分子分型時代已經(jīng)來臨95靶向藥物與靶點信息癌癥類型突變類型靶向藥物非小細(xì)胞肺癌EGFRmutationgefitinib,afatinib,erlotinib非小細(xì)胞肺癌ALKfusionceritinib,crizotinib非小細(xì)胞肺癌ROS1fusioncrizotinib非小細(xì)胞肺癌RETfusioncabozantinib非小細(xì)胞肺癌METamplificationcrizotinib非小細(xì)胞肺癌ERBB2mutationafatinib非小細(xì)胞肺癌BRAFmutationdabrafenib,vemurafenib結(jié)直腸癌NRASmutationcetuximab,panitumumabcontraindicated結(jié)直腸癌KRASmutationcetuximab,panitumumabcontraindicated胃腸道間質(zhì)腫瘤KITmutationimatinibmesylate胃腸道間質(zhì)腫瘤PDGFRAmutationdasatinib黑素瘤BRAFmutationdabrafenib,trametinib,vemurafenib胃癌ERBB2amplificationtrastuzumab乳腺癌ERBB2amplificationpertuzumab,trastuzumab96Fusion檢測:檢測對象及內(nèi)參(targetsandinternalcontrol)3’Gene5’PartnersVariants(N.)*ALKEML4,HIP1,KIF5B,KLC1,TPR26ROS1CD74,EXR,GOPC,LRIG3,SDC4,SLC34A2,TPM315RETCCDC6,CUX1,KIF5B9NTRK1CEL,NFASC,IRF2BP2,TFG,QSTM1,SSBP2,DYNC2H1,CD74,MPRIP9RNAqualitycontrol(內(nèi)參):amplificationofhousekeepinggenes(看家基因)MYC,ITGB7,LMNA,HMBS,TBP*>60specificdesignsforcancerrelevantfusionsaccordingtoPubMed針對已報道fusion設(shè)計引物97IonAmpliSeq?ComprehensiveCancerPanelv1.0

分析409

個腫瘤基因全外顯子區(qū)域，約16,000擴(kuò)增子。一張318芯片檢測一個標(biāo)本。Exon1

Exon2Exon3(3）癌癥綜合突變：助力腫瘤研究，有的放矢挖掘數(shù)據(jù)98癌肉瘤全基因組測序：

只列出460個基因，找到6個點突變，4個擴(kuò)增。收費(fèi)xxxxx元，耗時18天，未發(fā)現(xiàn)靶向藥物CDKN2BAmplification(8.52X)CYP2D6Amplification(8.72X)DPYDexon2:c.C85T:p.R29CEPHB1exon8:c.G496A:p.E166KLIMK1exon5:c.C386T:p.S129LMYCAmplification(9.34X)NCAM1exon1:c.1delC:p.Q1fsSOX10Amplification(8.08X)UGT2Bexon5:c.T1172C:p.V391AWEE1exon1:c.A269G:p.E90G其余3.6萬個基因，均無發(fā)現(xiàn)實體瘤變異圖譜DataanalysisperformedusingtheOncomineKnowledgebase(4)腫瘤突變和治療方案的關(guān)聯(lián)性證據(jù)腫瘤指示腫瘤突變用藥指導(dǎo)FDAApprovedLabelsBreastCancerERBB2amplificationPertuzumab（帕妥珠單抗）,trastuzumab（曲妥單抗）ColorectalCancerKRASmutationCetuximab(西妥昔單抗),panitumumabcontraindicated(帕尼單抗)GastricCancerERBB2amplificationtrastuzumab（曲妥單抗）MelanomaBRAFmutationDabrafenib(達(dá)拉非尼),trametinib(曲美替尼),vemurafenib(威羅菲尼片)Non-SmallCellLungCancerALKfusionCeritinib(色瑞替尼),crizotinib(克唑替尼)Non-SmallCellLungCancerEGFRmutationAfatinib(阿法替尼),erlotinib(厄洛替尼)NCCNGuidelinesGastrointestinalStromalTumorPDGFRAmutationDasatinib(達(dá)沙替尼)ColorectalCancerNRASmutationcetuximab(西妥昔單抗),panitumumabcontraindicated(帕尼單抗)MelanomaKITmutationimatinib(伊馬替尼)mesylateNon-SmallCellLungCancerBRAFmutationdabrafenib(達(dá)拉非尼),,vemurafenib(威羅菲尼片)Non-SmallCellLungCancerERBB2mutationafatinib(阿法替尼)Non-SmallCellLungCancerMETamplificationCrizotinib(克挫替尼）Non-SmallCellLungCancerRETfusionCabozantinib（卡博替尼）Non-SmallCellLungCancerROS1fusioncrizotinib(克挫替尼）12種不同的腫瘤突變和14種FDA審批的治療藥物相關(guān)101客戶定制：腫瘤化療敏感性基因檢測及藥物指導(dǎo)panel

3:腫瘤化療藥物毒性檢測1024:基于ctDNA&CTC的無創(chuàng)腫瘤檢測(液體活檢)ctDNA，即無細(xì)胞循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA）。指原發(fā)癌中細(xì)胞凋亡和壞死后，腫瘤DNA降解并釋放進(jìn)循環(huán)血液中，游離于細(xì)胞外的小片段核酸；CTC，即循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcell)，指從原發(fā)腫瘤脫落在血循環(huán)液中的一些完整細(xì)胞，其可能促成了轉(zhuǎn)移，在外周血中CTC的數(shù)量極少（約1個CTC/107白細(xì)胞/ml血液）。早發(fā)現(xiàn):可用于早期無創(chuàng)檢測和監(jiān)控癌癥病人的狀態(tài)；

用藥指導(dǎo)及耐藥性追蹤:無創(chuàng)檢測是否適用某種靶向藥物，及追蹤是否發(fā)生靶向治療的耐藥突變，時時調(diào)整治療策略；預(yù)后監(jiān)測:癌癥病人無創(chuàng)愈后監(jiān)測，看治療后疾病是否復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移。CynvenioLiquidBiopsyTM系統(tǒng)結(jié)合cancerhotspotpanel：

實現(xiàn)無創(chuàng)液體活檢104~294,000primerpairsacross12primerpools

>24,500-plexPCR!每個96孔板可以做8個外顯子樣本!起始低至50nggDNA覆蓋了>97%CCDS數(shù)據(jù)庫內(nèi)的信息(Release12)>19,000codinggenes,>198,000codingexons,noUTRs,miRNAs,orncRNAs~85%人類疾病相關(guān)的突變都是在編碼區(qū)或剪接區(qū)域Ampliconsizerange225-275bp

Averageinsertsizeis~202bp2-3個樣本/P1chip5:腫瘤樣本全外顯子測序IonAmpliSeq?Exome1056：腫瘤全基因組差異表達(dá)檢測適用人全基因組表達(dá)分析全面覆蓋RefSeq-20,802genes單管PCR/sampleFFPE樣本適用，低至10ngtotalRNA起始無需純化mRNA或去除rRNA~110bpaverageinsertsize(~150bpampliconsize)IonSuite友好界面數(shù)據(jù)分析插件Proton：8samples/P1chipIonAmpliSeq?Transcriptome106

環(huán)境質(zhì)控

操作環(huán)境的質(zhì)控千萬要警惕氣溶膠的污染：指數(shù)級增長2n劃分區(qū)域，注意風(fēng)向減少開蓋，定期紫外照射選擇污染幾率小的方法實驗室的布局質(zhì)量手冊、管理程序文件、操作程序文件、作業(yè)指導(dǎo)書、記錄表格等對實驗室的要求：訂購質(zhì)量運(yùn)輸接收驗貨/質(zhì)檢記錄（批號/有效期）儲存（冰箱位置）銷毀記錄（批號/操作者/日期）檢測（本批號）DNA抽提/定量操作規(guī)范PCR上樣、上機(jī)及對照設(shè)立操作規(guī)范陽性和陰性對照記錄（檢測日期/標(biāo)本號/操作者）儲存（冰箱位置）良好的室內(nèi)外質(zhì)控室獲得準(zhǔn)確結(jié)果的保證內(nèi)部質(zhì)控實驗室內(nèi)部功能分區(qū)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（sop）內(nèi)部質(zhì)控體系實驗人員上崗培訓(xùn)外部質(zhì)控、衛(wèi)生部國家病理質(zhì)控中心（PQCC)實驗室室間比對長海醫(yī)院歐洲分子遺傳檢測質(zhì)控網(wǎng)（EMQN）外部評價計劃EGFR突變檢測證書院內(nèi)規(guī)范的標(biāo)本送檢流程標(biāo)本檢測規(guī)范流程同意開展新項目臨床相關(guān)科室支持臨床基因擴(kuò)增實驗室認(rèn)證

實驗操作人員應(yīng)具有PCR實驗室上崗證結(jié)果和報告審核人員院方支持實驗室認(rèn)證實驗人員檢測SOP流程

分子檢測建設(shè)的步驟DNA測序的質(zhì)量控制DNA測序的標(biāo)準(zhǔn)體系建立各種方法間的相互印證實驗室間的相互印證對照體系的設(shè)置第五節(jié)基因多態(tài)性及其檢測人類基因組是一個結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定的系統(tǒng)，不同民族和群體有著相同的染色體數(shù)目和基因分布，核苷酸序列也基本相同。在整個進(jìn)化過程中，DNA序列也在不斷地發(fā)生變異，有的變異是有益的、或有害的、或不產(chǎn)生表型(中性)。這些變異中的一部分被保存下來，導(dǎo)致了不同種族、群體和個體間基因組的多態(tài)性。一DNA多態(tài)

DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：

群體中每個個體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。它通過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標(biāo)記。DNA分析中常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性（VNTR）：如短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3）單堿基多態(tài)性（SNP）：DNA序列的單個核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。二、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性基于數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)的發(fā)現(xiàn)，一般將60bp～70bp的串聯(lián)重復(fù)稱為小衛(wèi)星DNA,又稱VNTR,1bp～4bp的串聯(lián)重復(fù)稱為微衛(wèi)星DNA(簡單重復(fù)序列),具有豐富的多態(tài)性,高度雜合性、重組率低的特點，可作為DNA的多態(tài)性標(biāo)記，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是指簡單重復(fù)序列的增加或丟失。

通過合成特異位點的PCR序列，經(jīng)擴(kuò)增后凝膠分析或測序儀分析，檢測其不穩(wěn)定性。應(yīng)用最多的為DNA錯配修復(fù)基因的檢測。微衛(wèi)星位點的雜合性缺失

AB胰腺癌組織中微衛(wèi)星位點的雜合性缺失。A為正常對照，B為腫瘤組織，箭頭所指為雜合性缺失條帶。三、單核苷酸多態(tài)性分析-SNP

SNP是在人類基因組研究基礎(chǔ)上發(fā)展的第三代多態(tài)性標(biāo)記。估計在人類基因組中約有900萬個SNP位點，可用于易感基因檢測、復(fù)雜疾病的基因定位、疾病關(guān)聯(lián)分析、分子遺傳學(xué)、藥物設(shè)計及法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。傳統(tǒng)檢測方法:特定位點引物合成、PCR擴(kuò)增后凝膠電泳或測序儀分析。存在問題:位點的選擇、特異性等。基因芯片的技術(shù):

胰腺癌中SNP位點的多態(tài)性檢測NT胰腺癌中SNP位點的多態(tài)性。N為正常組織，T為腫瘤組織，箭頭所指的泳動變位條帶即為多態(tài)性位點。第六節(jié)染色體易位及其檢測技術(shù)染色體易位是指細(xì)胞核內(nèi)兩條非同源染色體各發(fā)生一處斷裂，并交換其無著絲粒節(jié)段，形成兩個融合后的新染色體的過程。染色體易位的檢測

RT-PCR的方法檢測染色體易位融合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA.原位雜交(FISH、C