外周血染色體標(biāo)本制作

外周血染色體標(biāo)本制作第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日一、染色體標(biāo)本制備原理在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，為了使細(xì)胞質(zhì)透明，離解胞間層，使組織軟化，且使染色體彼此鋪展開而又能清楚地顯示縊痕，往往需要對(duì)正在分裂或已經(jīng)收獲的細(xì)胞作一系列預(yù)處理。有時(shí)，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定的時(shí)候，為了使固定劑迅速滲透到組織中，以便于研究染色體的特殊結(jié)構(gòu)，也需要作預(yù)處理；其目的是使細(xì)胞的核外條件及染色體本身的狀態(tài)更適于分析和研究的需要。在細(xì)胞培養(yǎng)（培養(yǎng)基中加有PHA）后72小時(shí)，合成DNA的細(xì)胞占總數(shù)的45％，有絲分裂的速率相當(dāng)于每小時(shí)1%，被激活的淋巴細(xì)胞占總數(shù)的90%，是收獲分裂期細(xì)胞、制備染色體標(biāo)本的最佳時(shí)期。從收獲到制片需經(jīng)過加紡錘體抑制劑、低滲處理、固定、滴片等幾個(gè)主要環(huán)節(jié)，現(xiàn)將各步驟的原理、所用試劑及相關(guān)注意事項(xiàng)詳述如下。第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日1紡錘體抑制劑1.1基本原理和機(jī)制使染色體散開并清楚地呈現(xiàn)次縊痕，憑借的原理是改變細(xì)胞質(zhì)的粘度。因?yàn)樵诩?xì)胞分裂時(shí)，隨著紡錘體的形成，染色體緊靠在一起，很難進(jìn)行分析。紡錘體的形成取決于細(xì)胞質(zhì)和紡錘體成分的粘度之間的平衡。因此，改變細(xì)胞質(zhì)的粘度就能破壞紡錘體，使染色體依然呈游離狀態(tài)，或者更確切地說，染色體不再粘附至細(xì)胞內(nèi)的任何結(jié)合力上。所以在隨后制作標(biāo)本時(shí)一旦受到壓力，染色體就很易鋪展開來。同時(shí)，由于染色體的不同區(qū)段上水合作用的能力不一，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)的粘度發(fā)生變化時(shí)，就會(huì)使縊痕區(qū)顯示得更為清楚。第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日1紡錘體抑制劑細(xì)胞分裂中紡錘體是由微管組成的。微管管壁由13條原絲縱向平行排列構(gòu)成，主要成分為微管蛋白，而微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白兩種。α微管蛋白和β微管蛋白組成的異二聚體構(gòu)成微管亞單位，若干個(gè)異二聚體相接連成原絲。α微管蛋白與β微管蛋白在化學(xué)結(jié)構(gòu)上極為相似，兩者42%序列相同。其中β微管蛋白肽鏈中第201位為半胱氨酸，為秋水仙素結(jié)合部位。如果結(jié)合的部位被其結(jié)合，微管不僅不能繼續(xù)聚合，而且會(huì)引起原有微管解聚。第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日1紡錘體抑制劑故秋水仙素具有干擾微管裝配，破壞紡錘體形成和終止細(xì)胞分裂的作用。以秋水仙素為代表的紡錘體抑制劑能引起有絲分裂過程中紡錘絲斷裂或抑制紡錘體的形成，但不影響染色體的復(fù)制和著絲粒的分裂使正在分裂的細(xì)胞停留在中期，以獲得大量分裂相供分析之用。秋水仙素積累分裂中期的作用，幾乎對(duì)所有植物器官和許多動(dòng)物的器官都是十分有效的。第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日1紡錘體抑制劑1.2主要的紡錘體抑制劑及其作用特點(diǎn)秋水仙素秋水仙素（colchicine）是一種生物堿，因最初從百合科植物秋水仙（Colchicumautumnale）中提取出來，故名。分子式C22H25O6N。純秋水仙素呈黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)157℃。易溶于水、乙醇和氯仿，難溶于熱水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期。這種由秋水仙素引起的不正常分裂，稱為秋水仙素有絲分裂（C-mitosis）。在這樣的有絲分裂中，染色體雖然縱裂，但細(xì)胞不分裂，不能形成兩個(gè)子細(xì)胞，因而使染色體加倍。第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日1紡錘體抑制劑秋水仙素的作用與其濃度和作用時(shí)間相關(guān)，在高濃度時(shí)可以延緩著絲點(diǎn)分裂，低濃度時(shí)則抑制細(xì)胞紡錘體的形成。

在秋水仙素作用下，染色單體縮短，著色變深以致外形清晰。但不同染色體縮短的程度不一，長的染色體比短的染色體濃縮得更明顯些。從能收集到足夠的中期細(xì)胞考慮，秋水仙素處理的時(shí)間宜長些，所用的濃度宜高些；但從能得到較為細(xì)長的染色體考慮，處理的時(shí)間宜短，所用的濃度宜低。因而秋水仙素處理的方法應(yīng)同時(shí)兼顧這二個(gè)方面。如果處理的時(shí)間太短則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少；與此相反，如果處理的時(shí)間太長分裂細(xì)胞雖多，但染色體縮得太短，以致形態(tài)模糊，就難以獲得優(yōu)良的顯帶標(biāo)本。第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日1紡錘體抑制劑與其它預(yù)處理化學(xué)物相比較秋水仙素的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在廣泛的溫度范圍內(nèi)都是有活性的。在熱帶地區(qū)的夏季，那怕氣溫高達(dá)43.3℃，對(duì)秋水仙素的活性也無顯著影響，有人將秋水仙素加入保存在8—9℃的組織中，發(fā)現(xiàn)中期細(xì)胞的數(shù)目比保存在室溫但未加秋水仙素的組織要多得多，而且染色體的結(jié)構(gòu)也很清楚。乙酰甲基秋水仙堿是人工合成的秋水仙素的衍生物。它的功能跟秋水仙素一樣但對(duì)細(xì)胞的毒害作用只有秋水仙素的1／30一1／40。4—6×10-6的濃度即可得到所希望的效應(yīng)。除了秋水仙素以外，另一些化學(xué)物也可作為紡錘體抑制劑。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸長春花堿等，它們?cè)谌梭w細(xì)胞均可產(chǎn)生良好效果。第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日1紡錘體抑制劑1.3處理過程培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)基中加入濃度為20μg/ml的秋水仙素0.05~0.1ml（1ml注射器滴垂直3-5滴）使其最終濃度為0.4~0.8μg/ml，置5%CO2、37oC±0.5oC培養(yǎng)箱中處理2~4h。第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日1紡錘體抑制劑

1.4注意事項(xiàng)應(yīng)當(dāng)注意的是經(jīng)秋水仙素處理后的細(xì)胞雖可用各種不同的固定液(金屬固定液或非金屬固定液)予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素從組織或細(xì)胞上沖洗掉，否則沉積在細(xì)胞表面的秋水仙素不僅會(huì)影響染色體的形態(tài)，而且還會(huì)阻礙固定液的穿透性。為此，在低滲處理后，應(yīng)盡早地加快速穿透液，如甲醇—冰醋酸固定液。要不然在固定的時(shí)候，細(xì)胞核仍可能進(jìn)入代謝期。第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日2低滲溶液

經(jīng)過秋水仙素處理后，細(xì)胞內(nèi)的染色體比較適合于觀察了，但還是不能滿足要求。因?yàn)槿祟惣?xì)胞的染色體數(shù)目多，形狀小，最大的染色體約7—8微米，加之主要的觀察與分析均在油鏡下進(jìn)行，這就要求標(biāo)本中的染色體彼此散開，并且盡可能處于同一平面上。這些均有賴于低滲處理。第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日2低滲溶液2.1基本原理和機(jī)制1965徐道覺發(fā)現(xiàn)未作低滲處理時(shí)，伴隨染色體的一些零亂的物質(zhì)類似于核糖核蛋白體的顆粒，顯然是有絲分裂中核仁崩潰時(shí)的殘存物。而低滲處理后，這些物質(zhì)就消失了。可見，低滲處理不只是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展，而且還可使粘附于染色體的核仁物質(zhì)散開，這樣就能看清楚每一個(gè)扭曲的染色體?，F(xiàn)在知道，覆蓋在染色體上的核仁物質(zhì)大大地阻礙著染色體的分散。第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日2低滲溶液2.2主要的低滲液低滲溶液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低的溶液?？梢允撬⒌蜐B的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀(0.65mol／L)、氯化鉀(0.075mol／L)、稀釋的平衡鹽溶液或培養(yǎng)基。處理時(shí)間一般為8—40分鐘，處理時(shí)的溫度為23—37℃。在早期的一些研究中，大多用檸檬酸鈉或檸檬酸鉀作為低滲液。也有些學(xué)者主張用稀釋的人血清，認(rèn)為這樣可使染色體的形態(tài)特征更為清晰。自1965年后，人們改用KCl為低滲掖。其優(yōu)點(diǎn)是染色體的輪廓清楚，可染色性增強(qiáng)，染色時(shí)間短。在相差顯微鏡下觀察．KCl低滲處理標(biāo)本的效果比其它低滲液更好些，也適合于顯微分光光度分析，當(dāng)用顯帶染色時(shí)能充分顯示帶型的特點(diǎn)。KCl的濃度以0.075mol／L為宜，但不同組織所需的處理時(shí)間未必相同。第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日2低滲溶液2.3低滲處理過程秋水仙素處理2-4小時(shí)后，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用滴管將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到10ml離心管并置離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速為1500rpm，離心10min。離心后用滴管吸棄上清液，培養(yǎng)物沉積在管底。然后加入37o溫育的低滲液8毫升，用滴管吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，置37oC水浴處理20-30min，使紅細(xì)胞破碎，白細(xì)胞膨脹。第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日2低滲溶液2.4影響低滲效果的因素影響低滲處理的效果是以下三個(gè)因素：低滲溶液的化學(xué)組成、低滲的強(qiáng)度和處理的時(shí)間。處理時(shí)間太短則染色體鋪展不好，處理時(shí)間過長會(huì)引起細(xì)胞破裂甚至由于染色體脹得太大而致形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊。因此，在實(shí)際操作中，對(duì)某一種組織究竟應(yīng)選用哪一種低滲溶液，需事先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定固定是組織、細(xì)胞或其成分選擇性地固定于某一特定階段的過程。其目的是殺死細(xì)胞但又要避免所研究的成分受到破壞。不同物種對(duì)固定劑的反應(yīng)是不一的，哺乳類動(dòng)物染色體的固定尤其需要特定的方法，這是因?yàn)槊糠N生物的細(xì)胞質(zhì)成分彼此各異的緣故。生物類型本身的復(fù)雜性及多細(xì)胞生物中細(xì)胞內(nèi)的變化較大，以致很難在細(xì)胞水平上分析固定的效應(yīng)。第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定3.1基本原理與機(jī)制用于固定的化學(xué)物對(duì)細(xì)胞都具有殺死作用，這類化學(xué)物可分成二大類：一類能使染色體固縮，或使核酸和蛋白質(zhì)纖絲相脫離，另一類則可維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性。為使染色體結(jié)構(gòu)不受破壞，提高染色體的可見性及嗜堿性，就需要使染色質(zhì)物質(zhì)沉淀。在活體條件下，細(xì)胞內(nèi)不同成分之間的相差并不足以使它們成為一種明顯的單位?？墒请S著蛋白質(zhì)的凝結(jié)和沉淀，染色體的折射系數(shù)將發(fā)生很大的變化從而使它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)成為明顯的小體。正因?yàn)槿绱耍袼玫墓潭▌┒季哂薪绘湹鞍踪|(zhì)的特性，都能使染色質(zhì)沉淀。盡管常用的染色體固定劑往往是數(shù)種化學(xué)物的混合物，但其中至少有一種化學(xué)物必須具備這一特性。第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定固定劑的另一重要特性是能迅速地穿透組織或細(xì)胞，并在—瞬間內(nèi)殺死它們，這樣方能使正在分裂的細(xì)胞立即阻留在各自的時(shí)相上。瞬間殺死是很重要的，否則核分裂仍可繼續(xù)下去并到達(dá)所謂的“休止相”或“代謝相”，那就無從研究染色體了。第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定

可是，隨著細(xì)胞的死亡而出現(xiàn)的另一些變化(特別是蛋白質(zhì)的自溶作用)，往往會(huì)破壞染色體的原來結(jié)構(gòu)。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的酶參與蛋白質(zhì)的合成，而當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，由于介質(zhì)變?yōu)樗嵝?，這些酶便在相反方向起作用，即使復(fù)合蛋白質(zhì)裂解為簡(jiǎn)單的氨基酸。因?yàn)槎嚯氖侨旧w的主要成分之一，所以這種變性效應(yīng)最終將引起染色體結(jié)構(gòu)的破壞。因此，作為一種固定劑也應(yīng)能防止蛋白質(zhì)的自溶作用。此外，在細(xì)胞致死的同時(shí)，細(xì)菌的活動(dòng)致使細(xì)胞內(nèi)成分的分解。因此一種好的固定劑應(yīng)當(dāng)既能起到防腐作用，又能阻止細(xì)菌的分解作用。第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定最后，理想的固定劑還應(yīng)能有助于達(dá)到優(yōu)良的染色效果，即能增強(qiáng)染色體的嗜堿性。例如，甲醛雖具有優(yōu)良固定劑的其它所有特性，但卻會(huì)降低染色體的嗜堿性，所以不能單獨(dú)用作染色體的固定劑。顯而易見，沒有哪一種化學(xué)物能同時(shí)具備以上這些條件，因而通常是將數(shù)種可以共存的液體混合起來，使之成為染色體研究中真正有效的固定劑。盡管如此，那怕是最佳固定劑仍難免有不足之處。首先，細(xì)胞被殺死后發(fā)生的基本變化很難予以避免；其次，可能會(huì)抽提出一些彌散成分；最后即使操作十分謹(jǐn)慎，仍難以保持酶活性不變；此外，某些化學(xué)物還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的皺縮。第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定細(xì)胞的膨脹和染色體的皺縮是決定固定劑質(zhì)量的兩個(gè)重要因素。以往曾認(rèn)為滲透壓是促使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)膨脹或破壞的決定性因索，為此選用等滲液作為固定劑，其實(shí)這種看法是不正確的。事實(shí)證明，稀釋的醋酸具有20個(gè)大氣壓，照常可使細(xì)胞和組織膨脹，而只有2.5個(gè)大氣壓的苦味酸卻可使組織大大地收縮。這提示一種固定劑的效果如何與滲透壓的關(guān)系很小。另一方面，苦味酸使蛋白質(zhì)沉淀的作用很強(qiáng)而醋酸卻沒有這一作用。可見，使蛋白質(zhì)沉淀這一特性在導(dǎo)致染色體收縮方面可能起重要作用。因此，在選用哪些化學(xué)物作為固定劑時(shí)，需要權(quán)衡以上這些因素。第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定用作固定劑的化學(xué)物有非金屬和金屬兩類。前者如乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。后者如鉻酸、鋨酸、氯化鉑、氯化汞、硝酸鈾等。其中有幾種化學(xué)物還可作為蒸氣固定劑，也即在接觸水或其它溶劑之前使可溶性物質(zhì)先轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，這樣就可在原位制作標(biāo)本。在細(xì)胞化學(xué)研究上，大多數(shù)非金屬固定劑(除甲醛外)比之于金屬固定劑有一優(yōu)點(diǎn)是，在固定之后無需在水中沖洗標(biāo)本。第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定3.2固定液的種類醋酸作為混合固定液的一種成分，醋酸的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）可以與已知的任何一種固定劑同時(shí)使用，并且可以和任意比例的水、乙醇或甲醇混合；（2）濃度可以很低（1%）也可以很高（99%）；（3）具有很強(qiáng)的穿透性能，比乙醇的穿透性還高。醋酸能使核酸沉淀使組蛋白溶解，但卻不能固定細(xì)胞質(zhì)蛋白。在染色體結(jié)構(gòu)的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色體收縮，使染色體的結(jié)構(gòu)免于被破壞。經(jīng)醋酸固定的物質(zhì)還能抵銷乙醇的硬化作用。第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定醋酸是染色體的一種理想的固定劑，它可使染色體結(jié)構(gòu)保持完整，且多半不致破壞核蛋白。這種固定劑的一個(gè)缺點(diǎn)是會(huì)導(dǎo)致染色體片段的過分膨脹，因此如果要研究染色體的詳細(xì)結(jié)構(gòu)，必須把它與乙醇或類似的化學(xué)物一道使用，后者能使組織收縮和硬化。在研究減數(shù)分裂的染色體時(shí)，如果目的是了解染色體的行為，而不是其結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，用醋酸作為固定劑當(dāng)然是十分恰當(dāng)?shù)?。在分析粗線期的染色體時(shí)要求染色體的細(xì)節(jié)清晰，醋酸也不愧是一種理想的固定劑。此外，醋酸還是苯胺類染料的一種優(yōu)良溶劑。正因?yàn)榫哂羞@一特性，它是染料和固定液混合物中必需的一種成分，例如醋酸—洋紅、醋酸—奧辛和醋酸—間苯二酚藍(lán)等。第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定甲醇在植物染色體研究中極少應(yīng)用，可是卻廣泛地用于動(dòng)物染色體的固定。甲醇是從木材分解蒸餾制得的，是焦木酸的一種成分。雖然乙醇會(huì)使染色體收縮得很厲害，而甲醇卻可使染色體膨脹。在制備固定液時(shí)往往需要一種膨脹劑以補(bǔ)償另一些化學(xué)品的收縮效應(yīng)，所以甲醇這一特性是非常有用的。它的有效濃度為70％至100％。它是一種無色有毒的液體且可以任何比例與水混合。但不能與氧化劑一道，否則很快會(huì)氧化成甲酸。第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定乙醇廣泛地用作染色體固定劑的一種成分。它的有效濃度與甲醇一樣。乙醇有一個(gè)最重要的優(yōu)點(diǎn)是能迅速地穿透人組織。它可以沉淀蛋白質(zhì)，還具有脫水性．可使蛋白質(zhì)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的變性，還能使組織硬化。作為一種還原劑，在有氧化劑存在時(shí)乙醇會(huì)很快被氧化為乙酸。所以它不能與許多金屬固定劑(鉻酸或四氯化鋨)相混用。乙醇不能有效地固定染色質(zhì)，原則上不能與醋酸、甲醛或氯仿混合使用?？墒抢涞囊掖脊潭ǚㄍ鼙４婺承┟?，因?yàn)槊傅姆磻?yīng)基團(tuán)—般是不受它破壞的。在對(duì)染色體的酶進(jìn)行研究時(shí)，宜用80％冷乙醇固定1小時(shí)或更多時(shí)間；如用于單層培養(yǎng)物，往往以純乙醇或95％的乙醇固定1-15分鐘為宜。第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定卡諾固定液。卡諾固定液由1份冰醋酸和3份甲醇或乙醇混合而成。這種固定液適用于所有的動(dòng)植物和人類染色體的固定。固定的時(shí)間為15分鐘到24小時(shí)，溫度為室溫或稍冷。必要時(shí)可以改變酸和醇的比例，例如改成1:2或1:4等。隨著醋酸比例的增高，固定液膨脹的效能加大，有利于染色體的鋪展；但是如果控制不當(dāng)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎，反而不利于分析?？ㄖZ固定液的一個(gè)缺點(diǎn)是經(jīng)這種方式固定的組織不能被許多堿性染料的水溶液染上色，除非用一些特殊的媒染劑。這是因?yàn)楣潭ㄒ褐腥狈τ兄谌旧w嗜堿性的金屬成分。第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日3固定3.3固定的過程預(yù)固定：低滲30分鐘后