課題 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

課題微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)第一頁，共六十四頁，2022年，8月28日

專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)需要為微生物提供合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件需要無菌操作

第二頁，共六十四頁，2022年，8月28日課題目標(biāo)：1.了解有關(guān)微生物種類、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí)。2．進(jìn)行無菌技術(shù)的操作。3．進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。第三頁，共六十四頁，2022年，8月28日生物技術(shù)實(shí)踐：微生物培養(yǎng)與利用：

利用微生物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)特定的產(chǎn)物。生物學(xué)研究中的科學(xué)思想和一般方法：

設(shè)計(jì)可行的實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)裝置

對(duì)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案做出恰當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)和修訂《考試說明》從近年情況看，這部分知識(shí)在各區(qū)的模擬考查中多次涉及！尤其是關(guān)于滅菌方法和接種方法的選擇是高頻考點(diǎn)第四頁，共六十四頁，2022年，8月28日

知識(shí)梳理：細(xì)菌大腸桿菌淋病球菌肉毒梭菌霍亂弧菌（單細(xì)胞原核生物）1.細(xì)菌的形態(tài)（球、桿、弧、旋）第五頁，共六十四頁，2022年，8月28日2.細(xì)菌的結(jié)構(gòu)

知識(shí)梳理：細(xì)菌第六頁，共六十四頁，2022年，8月28日

知識(shí)梳理：細(xì)菌2.細(xì)菌的結(jié)構(gòu)（6）芽孢第七頁，共六十四頁，2022年，8月28日2.細(xì)菌的結(jié)構(gòu)

知識(shí)梳理：細(xì)菌

某些細(xì)菌在其生長(zhǎng)發(fā)育后期，在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形或橢圓形、厚壁、含水量極低、抗逆性極強(qiáng)的休眠體，稱為芽孢(內(nèi)生孢子）。

能夠使細(xì)菌度過不良的環(huán)境。每一個(gè)細(xì)菌形成一個(gè)芽孢，所以其沒有繁殖功能。芽孢第八頁，共六十四頁，2022年，8月28日

知識(shí)梳理：細(xì)菌3、細(xì)菌的繁殖：細(xì)菌的主要繁殖方式：——分裂生殖（二分裂）分裂中的鏈球菌分裂中的大腸桿菌第九頁，共六十四頁，2022年，8月28日4.菌落P18（★高三考查較多）（1）定義：是單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖，形成肉眼可見具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。舉例：有莢膜細(xì)菌：菌落光滑。S型

無莢膜細(xì)菌：菌落粗糙。R型（2）特征：表現(xiàn)在菌落的大小、形狀、光澤度、顏色、硬度透明度等方面。（3）功能：菌落特征是鑒別菌種的重要依據(jù)

知識(shí)梳理：細(xì)菌第十頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日(二)微生物培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基概念：人工配制的用于培養(yǎng)微生物（或動(dòng)物、植物的細(xì)胞、組織）的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2.培養(yǎng)基的成分：微生物的元素組成：微生物生長(zhǎng)需要的物質(zhì)——營(yíng)養(yǎng)要素C、H、O、N、P碳源、氮源、無機(jī)鹽、水第十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成培養(yǎng)基組分提供的主要營(yíng)養(yǎng)牛肉膏5g碳源、氮源、磷酸鹽、維生素蛋白胨10g碳源、氮源和維生素Nacl5g無機(jī)鹽H2O定容至1000ml氫元素、氧元素糖類、還可以是無機(jī)物，如CO2也可以是NH4+NO3-等無機(jī)物★同一種物質(zhì)可能既為碳源又為氮源嗎？可能，如牛肉膏，可提供氮源和碳源第十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日牛肉膏（BeefExtract）又稱牛肉浸膏，是采用新鮮牛肉經(jīng)過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。蛋白胨是將肉、酪素（酪蛋白水解得到）或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。第十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日思考：1.大腸桿菌，硝化細(xì)菌，藍(lán)細(xì)菌，乳酸菌分別選用哪種碳源？糖類，二氧化碳，二氧化碳，糖類第十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日(二)微生物培養(yǎng)基2.培養(yǎng)基的成分：（2）氮源概念：能為微生物提供所需氮元素的營(yíng)養(yǎng)

物質(zhì)種類：無機(jī)氮源：N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、

尿素；

有機(jī)氮源：牛肉膏、蛋白胨第十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日培養(yǎng)根瘤菌、大腸桿菌、硝化細(xì)菌時(shí)分別需要哪一類氮源？思考：N2，銨鹽或硝酸鹽，NH3第十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日(二)微生物培養(yǎng)基2.培養(yǎng)基的成分：注意：關(guān)于能量來源自養(yǎng)型： ①光能自養(yǎng)：太陽光 ②化能自養(yǎng)：無機(jī)物（氧化放能）異養(yǎng)型：有機(jī)物（氧化分解放能）（3）水

（4）無機(jī)鹽第十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日思考若乳酸菌、根瘤菌、固氮藍(lán)藻、硝化細(xì)菌混合在一起，我們配制什么樣的培養(yǎng)基可以將三種微生物分離？碳源氮源能源(物質(zhì))乳酸菌根瘤菌硝化細(xì)菌糖類等含碳有機(jī)物N2有機(jī)物銨鹽、硝酸鹽、有機(jī)氮糖類等含碳有機(jī)物有機(jī)物氨氨的氧化CO2第二十頁，共六十四頁，2022年，8月28日(二)微生物培養(yǎng)基3.滿足微生物生長(zhǎng)的條件：培養(yǎng)基除要提供上述幾種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還滿足微生物生長(zhǎng)的pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

和氧氣

等要求。①pH：真菌5.0~6.0酸性

細(xì)菌

6.5~7.5中性或微堿性第二十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日(二)微生物培養(yǎng)基（1）按物理性質(zhì)劃分：5.培養(yǎng)基的種類：（固體、半固體培養(yǎng)基需添加凝固劑，如瓊脂；兩者的差別是添加量的多、少）①液體培養(yǎng)基②半固體培養(yǎng)基③固體培養(yǎng)基（用于工業(yè)生產(chǎn)）（用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種）（用于微生物的分離、計(jì)數(shù)）微生物在其表面生長(zhǎng)可形成菌落第二十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日進(jìn)行選擇培養(yǎng)可以增加所需目的菌的濃度(二)微生物培養(yǎng)基5.培養(yǎng)基的種類：①選擇培養(yǎng)基P22：②鑒別培養(yǎng)基：加入某化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要微生物的生長(zhǎng)。加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒定不同種類的微生物。特定菌種顯色，其他菌種不受抑制、但不顯色。（3）按用途劃分：（作用：分離微生物、進(jìn)行選擇培養(yǎng)）

（作用：鑒別微生物）

第二十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日青霉素抗青霉素基因選擇培養(yǎng)基在基因工程中，對(duì)導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌的篩選第二十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日伊紅－美藍(lán)鑒別培養(yǎng)基AABBCCDD

大腸桿菌在伊紅－美藍(lán)培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)黑色第二十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日常見的選擇培養(yǎng)基舉例：

（1）添加： ①青霉素：抑制細(xì)菌、放線菌 保留（分離）真菌，如霉菌、酵母菌 ②高濃度NaCl：抑制多種細(xì)菌， 分離金黃色葡萄球菌(二)微生物培養(yǎng)基5.培養(yǎng)基的種類：（3）按用途劃分：第二十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日常見的選擇培養(yǎng)基舉例：（2）缺少： ①培養(yǎng)基缺少有機(jī)碳源 分離自養(yǎng)型微生物（利用CO2

） ②培養(yǎng)基缺少氮源 分離固氮微生物（利用N2

）(二)微生物培養(yǎng)基5.培養(yǎng)基的種類：（3）按用途劃分：第二十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日（三）無菌技術(shù)1.獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵(目的）是防止外來雜菌的入侵。第二十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日（三）無菌技術(shù)2.無菌技術(shù)包括：（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。第二十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日思考無菌技術(shù)除了防止培養(yǎng)物被污染外，還具有什么目的？有效避免操作者自身被微生物感染思考：消毒和滅菌的區(qū)別？哪一個(gè)更徹底？什么時(shí)候需要消毒，什么時(shí)候需要滅菌？第三十頁，共六十四頁，2022年，8月28日消毒是指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物營(yíng)養(yǎng)體（不包括芽孢和孢子）。滅菌是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌效果更徹底，用于各種金屬、玻璃器具。消毒用于各種實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手。（三）無菌技術(shù)2.無菌技術(shù)包括：第三十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日（三）無菌技術(shù)3.消毒方法：（1）日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；（2）對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法，如牛奶。（3）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線

進(jìn)行物理消毒。（4）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用70%酒精進(jìn)行消毒。（5）飲水水源用氯氣進(jìn)行消毒。第三十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日（三）無菌技術(shù)4.滅菌方法：（1）灼燒滅菌法：用于金屬用具（接種環(huán)、接種針）、試管口和瓶口的滅菌；第三十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日（三）無菌技術(shù)4.滅菌方法：（2）干熱滅菌法：用于耐高溫、需要保持干燥的物品。玻璃器皿、金屬用具的滅菌，所用設(shè)備是干熱滅菌箱

；160~170℃，1~2小時(shí)第三十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日（三）無菌技術(shù)4.滅菌方法：（3）高壓蒸汽滅菌法：用于培養(yǎng)基、無菌水等的滅菌，所用設(shè)備是

高壓蒸汽滅菌鍋

高壓滅菌鍋121℃，100kPa，15-30分鐘第三十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)操作

（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：2.稱量：3.溶化：加水定容，調(diào)pH4.滅菌：

5.倒平板：（或擱置斜面培養(yǎng)基）

包好再高壓蒸汽滅菌（121℃，100kPa，15-30分鐘）。培養(yǎng)基冷卻到50℃

，酒精燈火焰旁操作。第三十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日稱量第三十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日調(diào)pH第三十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基分裝第三十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日1/5第四十頁，共六十四頁，2022年，8月28日加棉塞2/3第四十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日包扎滅菌第四十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日擱置斜面斜面不超過試管總長(zhǎng)的1/2第四十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日倒平板夾倒灼倒第四十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日思考：（1）培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。可用__________________________________的辦法估計(jì)培養(yǎng)基的溫度。（2）為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

灼燒滅菌，防止瓶口被微生物污染。

感覺盛有培養(yǎng)基的錐形瓶不燙手第四十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日(3)平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也較高，將平板倒置，既可以防止培養(yǎng)基水分過快蒸發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。思考：第四十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日思考：(4)在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？不能；空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。第四十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日【提醒關(guān)于斜面培養(yǎng)的問題】配制斜面培養(yǎng)基中，試管要加塞棉塞的目的是保持通氣并防止雜菌感染。試管培養(yǎng)基形成斜面的作用是增大接種面積。第四十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日（二）純化大腸桿菌：1.純化培養(yǎng)技術(shù)：自然環(huán)境中，微生物混在一起生長(zhǎng)，要想純培養(yǎng)，首先要將單個(gè)細(xì)胞與其他細(xì)胞分離開，進(jìn)而培養(yǎng)成可見的群體（即菌落）。2.常見接種方法：★（高頻考點(diǎn)）平板劃線法：主要用于純化培養(yǎng)稀釋涂布平板法：主要用于分離菌種并計(jì)數(shù)第五十頁，共六十四頁，2022年，8月28日（二）純化大腸桿菌：2.常見接種方法：(1)平板劃線法：通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的菌落。此法主要用于純化培養(yǎng)接種環(huán)第五十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日模擬平板劃線：12345第五十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日

平板劃線第五十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日思考⑴為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？第一步灼燒：消滅接種環(huán)上的微生物避免污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒：為了殺死上一次劃線結(jié)束后，接種環(huán)殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。操作結(jié)束后灼燒：殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境及感染操作者。第五十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日思考⑵在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？避免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種⑶在作第二次及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。第五十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日（二）純化大腸桿菌：2.常見接種方法：(2)稀釋涂布平板法：將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋后，分別涂布到固體培養(yǎng)基表面。稀釋度足夠高時(shí)，能培養(yǎng)出單個(gè)菌落。主要用于分離菌種并計(jì)數(shù)。涂布器第五十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日系列稀釋9ml稀釋液1ml9ml稀釋液1ml10-110-29ml稀釋液9ml稀釋液9ml稀釋液9ml