生物工業(yè)菌種與種子的擴大培養(yǎng)

生物工業(yè)菌種與種子的擴大培養(yǎng)第一頁，共九十六頁，2022年，8月28日本章內(nèi)容一、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求二、工業(yè)微生物菌種的選育與改良三、工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏四、種子的擴大培養(yǎng)第二頁，共九十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)工業(yè)生產(chǎn)常用微生物及要求一、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物工業(yè)上用的微生物主要有六類：1．細菌（bacteria）例：枯草芽孢桿菌、乳桿菌2．酵母菌（yeast）例：啤酒酵母3．霉菌（mould）例：曲霉、青霉第三頁，共九十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)工業(yè)生產(chǎn)常用微生物及要求一、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物工業(yè)上用的微生物主要有六類：4．放線菌（actinomyeetes）

主要是生產(chǎn)各種抗生素。例：鏈霉菌生產(chǎn)鏈霉素；小單孢菌生產(chǎn)慶大霉素。5．擔子菌（basidiomycetes）也就是菇類。例：靈芝、香菇6．藻類（alga）一類自養(yǎng)性生物。例：螺旋藻、藍綠藻第四頁，共九十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)工業(yè)生產(chǎn)常用微生物及要求

二、微生物工業(yè)對菌種的要求具備四個條件：原料廉價、生長迅速、目的產(chǎn)物產(chǎn)量高；易于控制培養(yǎng)條件，酶活性高，發(fā)酵周期較短；抗雜菌和噬菌體的能力強；菌種遺傳性能穩(wěn)定，不易變異和退化，不生產(chǎn)任何有害的生物活性物質和毒素，保證生產(chǎn)安全。第五頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良微生物篩選基因突變（菌種選育）基因重組（菌種改良）基因直接進化自然選育（非定向篩選）誘變育種雜交原生質體融合DNA重組（半定向篩選）點突變易錯PCR同序法DNAshuffling(體外同源重組)（定向篩選）第六頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良一、工業(yè)微生物菌種的選育1.定義(1)自然選育在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，而根據(jù)菌種的自發(fā)突變進行菌種篩選的過程，叫做自然選育或者自然分離。用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變，從而進行的篩選，稱為誘變育種。(2)誘變育種第七頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良一、工業(yè)微生物菌種的選育2.兩者間的區(qū)別(1)選育過程自然選育：被動選擇，不對菌體做任何人工處理誘變育種：主動選擇，對菌體施加人工影響(2)選育效果要達到相同的水平，誘變育種所需要的時間要比自然選育的時間短很多；對選育工藝而言，一般先對菌群做自然選育；然后再做誘變育種，使其生產(chǎn)性能進一步提高。第八頁，共九十六頁，2022年，8月28日一、工業(yè)微生物菌種的選育3.自然選育自然選育又可以分為兩種情況：從自然界中分離獲得菌株從自發(fā)突變體中獲得菌株（重點）第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良第九頁，共九十六頁，2022年，8月28日一、工業(yè)微生物菌種的選育從自然界中分離獲得菌株一般過程：土樣（水樣）的采集預處理

增殖培養(yǎng)純種分離產(chǎn)品的鑒定及篩選復篩較優(yōu)菌株1-3株生產(chǎn)性能測試初步工藝條件摸索保藏、進一步做生產(chǎn)試驗或作為育種的出發(fā)菌株某些必要試驗和毒性試驗等第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良第十頁，共九十六頁，2022年，8月28日土樣（水樣）的采集地點的確定要根據(jù)篩選的目的、微生物的分布情況以及菌種的主要特征與外界環(huán)境關系等進行綜合、具體的分析來決定。I.地點的確定一般的話，可以從土壤中采樣，種類是最多的。II.采樣的操作方法用小鏟除去表層土壤，取離地面5-15cm處的土樣，放入預先消毒好的塑料袋中，扎好，記錄采樣時間、地點、環(huán)境情況等，以備日后考查。第十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日預處理處理土樣，為即將進行的培養(yǎng)做準備。I.目的II.操作方法如果是水樣，則不需要再制備懸液；如果是土樣，則將采集的土樣按一定的比例溶解在去離子水中，振蕩攪勻，制成樣品懸液。等待劃線。一般制成10-2菌懸液，也就是1g土樣放入99ml去離子水中。第十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日增殖培養(yǎng)針對目標菌株可能較少、雜菌較多而進行。操作目的是為了增加目標菌株的數(shù)量；如果目標菌株較多，則沒有必要，直接分離即可。I.目的II.定義給混合菌種提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌型生長的條件，以促使目標菌株大量繁殖，有利于分離，也叫富集培養(yǎng)。第十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日增殖培養(yǎng)(i)定向培養(yǎng)III.富集培養(yǎng)的方案采用特定的有利于目的微生物富集的條件進行培養(yǎng)。使用專一性底物、pH條件、培養(yǎng)時間以及培養(yǎng)溫度都是定向培養(yǎng)的方法。第十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日增殖培養(yǎng)III.富集培養(yǎng)的方案(ii)從菌種的分類學角度考慮目標菌種分離方法細菌霉菌放線菌培養(yǎng)基中添加濃度一般為50μg/ml的抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生長分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素，如青霉素和鏈霉素，抑制細菌生長懸液中加入10%的酚數(shù)滴，就可以抑制霉菌和細菌的生長第十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日III.富集培養(yǎng)的方案(iii)隨機分離從產(chǎn)物入手，通過設計高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術關鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應篩選方法的確定。增殖培養(yǎng)第十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日純種分離單菌落分離法分離方法：具體的操作主要有稀釋分離法和劃線分離法兩種。I.稀釋分離法操作步驟：①將樣品不斷的稀釋，使其分散到最低限度②然后將稀釋液涂布于培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)③待長出獨立的單個菌落，進行挑選分離。優(yōu)勢：在培養(yǎng)基上分離的菌落單一均勻，獲得純種的概率大。第十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日I.稀釋分離法單菌落第十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日單菌落分離法分離方法：II.劃線分離法操作步驟：①首先倒培養(yǎng)基平板②然后用接種針（接種環(huán)）挑取樣品，在平板上有規(guī)則的劃線。優(yōu)勢：簡單、快捷注意點：

采用單菌落分離法要注意菌體的分散度。有不同的菌體長在一起的話，有時會發(fā)生吻合現(xiàn)象，形成異核菌落。純種分離第十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日II.劃線分離法斜線法曲線法方格法放射法四格法第二十頁，共九十六頁，2022年，8月28日產(chǎn)品鑒定及篩選從兩個角度出發(fā)：產(chǎn)物角度、形態(tài)角度I.從產(chǎn)物角度出發(fā)也就是在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成來有目的的設計培養(yǎng)基。例：醛肟水解酶的篩選在培養(yǎng)基中加入0.05%的Z-PAOx，每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基，不斷分析樣品。第二十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日II.從形態(tài)角度出發(fā)也就是觀察菌落的外觀形態(tài)，它是微生物的一個重要表征。例：多糖產(chǎn)生菌在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上生長時，產(chǎn)生粘液性的菌落產(chǎn)品鑒定及篩選從兩個角度出發(fā)：產(chǎn)物角度、形態(tài)角度第二十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良一、工業(yè)微生物菌種的選育實例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選產(chǎn)生菌：嗜堿芽孢桿菌

自然選育過程：(a)采樣：造紙廠土樣(b)預處理：1g土樣溶于99ml去離子水中，振蕩均勻，過濾，得菌懸液(c)增殖培養(yǎng)：經(jīng)80℃，30分鐘預處理第二十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日自然選育過程：(e)鑒定篩選：選擇有凹陷圈的菌落，而且越大越好，得到初篩菌種。(f)復篩：通過生產(chǎn)性能測試，摸索條件，分析產(chǎn)酶率，得到1-3株較好菌株(g)保藏及進一步育種第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良一、工業(yè)微生物菌種的選育實例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選(d)分離純化：固體分離培養(yǎng)基采用CMC為唯一碳源，pH10.5條件下涂布培養(yǎng)3-4天第二十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日4.誘變育種定義：通過誘變劑處理菌種，大大提高菌種的突變頻率，擴大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株，稱為誘變育種。原理：采用物理、化學等誘變因素使微生物DNA堿基對排列發(fā)生變化，造成突變，從而使細胞功能發(fā)生改變。第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良一、工業(yè)微生物菌種的選育第二十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日突變方向正突變負突變對生產(chǎn)有利的突變稱為正突變。造成菌株衰退及生產(chǎn)質量下降的突變稱為負突變。菌株發(fā)生正突變的概率低。誘變育種的關鍵：以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物細胞懸浮液，使個別存活的個體中DNA堿基變異頻率大幅提高；4.誘變育種第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良一、工業(yè)微生物菌種的選育第二十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日優(yōu)勢：方法簡便、工作速度快、效果顯著。用合適的方法淘汰負效應變異株，選出極少數(shù)性能優(yōu)良的正變異株，培育優(yōu)良高產(chǎn)菌株。意義：誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能，而且能改進產(chǎn)品的質量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝等。4.誘變育種第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良一、工業(yè)微生物菌種的選育第二十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日誘變育種的一般程序：出發(fā)菌株的選擇菌懸液制備前培養(yǎng)誘變

中間培養(yǎng)變異菌株分離篩選4.誘變育種第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良一、工業(yè)微生物菌種的選育第二十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日出發(fā)菌株的選擇1、定義工業(yè)上用來進行誘變或基因重組育種處理的起始菌株稱為出發(fā)菌株(parentstrain)。2.滿足要求對誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高第二十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日出發(fā)菌株的選擇3.出發(fā)菌株種類出發(fā)菌株特點從自然界中分離得到的野生型菌株自發(fā)突變經(jīng)篩選得到的高產(chǎn)菌株（√）已誘變過的菌株對誘變因素敏感，容易發(fā)生變異與野生型菌株較相象，容易達到較好的誘變效果多次誘變可能效果迭加，積累更多的提高，但難度大第三十頁，共九十六頁，2022年，8月28日菌懸液的制備方法：同步培養(yǎng)法在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態(tài)一致的單倍體、單核細胞，即菌懸液的細胞應盡可能達到同步生長狀態(tài)，稱為同步培養(yǎng)。第三十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日菌懸液的制備同步化方法：菌種培養(yǎng)方法細菌霉菌放線菌一般要求培養(yǎng)至生長旺盛的對數(shù)期，變異率較高，重復性好使用剛剛成熟的分生孢子（將其放在液體培養(yǎng)基中短時間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體，易于誘變。）第三十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日菌懸液的制備具體操作：關鍵是制備一定濃度的分散均勻的單細胞或單孢子懸液。(1)細胞的同步培養(yǎng)；(2)過濾或離心、洗滌，并收集菌體；(3)配制菌懸液第三十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日菌懸液的制備具體操作：(i)用生理鹽水或緩沖溶液配制；注意點：(ii)應注意分散度；(iii)最后制得的菌懸液，霉菌孢子或酵母菌細胞的濃度大約為106~107個/ml，放線菌和細菌的濃度大約為108個/ml。第三十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日前培養(yǎng)誘變處理前，可以在加入嘌呤、嘧啶等堿基或酵母膏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30min。前培養(yǎng)可以使變異率大幅提高。第三十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日誘變定義：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑。誘變劑種類1.誘變劑物理誘變劑化學誘變劑紫外、X射線、γ射線、α射線、β射線、等離子、快中子、超聲波等甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)第三十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日誘變2.誘變機理核酸物質吸收一定能量的紫外線后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變。因此，紫外線的誘變作用是由于它引起DNA分子結構變化而造成的。第三十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日誘變2.誘變機理這種變化包括：DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)形成嘧啶二聚體。第三十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日誘變3.誘變儀器265nm的紫外光，對應于功率為15W的紫外燈4.誘變操作(1)將10ml菌懸液放在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，液層厚度約為2mm，啟動磁力攪拌器；(2)使用15W的紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時間以幾秒至數(shù)十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10min左右。第三十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日誘變5.注意點(1)為準確起見，照射前紫外燈應先預熱20~30min，然后再進行處理；(2)不同的微生物對于紫外線的敏感程度不一樣，誘變劑量也不同。目前趨向采用低劑量、長時間處理；(3)為了避免光復活現(xiàn)象，處理過程應在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培養(yǎng)，然后再進行分離篩選。第四十頁，共九十六頁，2022年，8月28日中間培養(yǎng)1.目的對于剛經(jīng)誘變劑處理過的菌株，有一個表現(xiàn)遲滯的過程（生理延遲），需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)不同變異菌體同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。2.后果第四十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日中間培養(yǎng)3.操作誘變處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，使細胞的遺傳物質復制，繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，穩(wěn)定的變異就會顯現(xiàn)出來。一般也就是過夜。第四十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選1.目的從誘變后的突變菌體中將少數(shù)發(fā)生正突變的菌體挑出來。2.分離篩選過程（以營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選為例）(1)淘汰野生型菌株(富集培養(yǎng))幾個定義營養(yǎng)缺陷型菌株

通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應缺陷的營養(yǎng)物質才能正常生長繁殖的變異菌株。第四十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(1)淘汰野生型菌株(富集培養(yǎng))基本培養(yǎng)基(MM)凡是能滿足野生菌株正常生長的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基(CM)

在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質，如蛋白胨、酵母膏等，能滿足各種營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的培養(yǎng)基；第四十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選補充培養(yǎng)基(SM)在基本培養(yǎng)基中只是有針對性的加入某一種或某幾種自身不能合成的有機營養(yǎng)成分，以滿足相應的營養(yǎng)缺陷型菌株生長的培養(yǎng)基。(1)淘汰野生型菌株(富集培養(yǎng))第四十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選分離方法：采用抗菌素法或菌絲過濾法菌種采用方法原理細菌酵母絲狀真菌、霉菌、放線菌抗生素法菌絲過濾法青霉素制霉菌素野生型菌株能在MM中生長，而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于“休眠狀態(tài)”，這時，加入一定量的抗生素，結果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。在基本培養(yǎng)基中，野生型的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再進行過濾。第四十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(2)檢出缺陷型(分離純化)目的：從淘汰野生型之后的混合菌株中篩選出純的缺陷型菌株。方法：影印法、夾層法、逐個檢出法、限量補充培養(yǎng)法第四十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(2)檢出缺陷型(分離純化)影印法檢出缺陷型的操作將誘變處理后的細胞涂布在完全培養(yǎng)基（CM）表面上，經(jīng)培養(yǎng)后長出菌落；然后用一小塊直徑比平皿稍小的圓柱形木塊覆蓋于滅過菌的絲絨布上作為接種工具，將長出菌落的平皿倒轉過來，在絲絨上輕輕按一下，轉接到另一基本培養(yǎng)基（MM）平板上；第四十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(2)檢出缺陷型(分離純化)影印法檢出缺陷型的操作經(jīng)培養(yǎng)后，比較這兩個平皿長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)前一平板上某一部位長有菌落，而在后一培養(yǎng)基上的相應部位卻沒有，就說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌落。第四十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選影印法圖例(2)檢出缺陷型(分離純化)第五十頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)方法：隨機篩選、形態(tài)篩選以及理性化篩選隨機篩選：菌種經(jīng)過誘變處理后，進行平板分離，隨機挑選單菌落，從中篩選高產(chǎn)菌株。形態(tài)篩選：一種半理性化的篩選方式。利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應直接挑取高產(chǎn)變異菌株。第五十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選形態(tài)篩選方法形態(tài)突變某些菌株的形態(tài)和生產(chǎn)性能直接相關，可以采用此種方法。如灰黃霉素產(chǎn)生菌。(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)第五十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選理性化篩選分為兩種情況：初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選、次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選。平皿反應平皿反應是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理效應，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標志。(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)形態(tài)篩選方法第五十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日聯(lián)系區(qū)別初級代謝次級代謝①初級代謝是次級代謝的基礎，它可以為次級代謝產(chǎn)物合成提供前體物和所需要的能量；②次級代謝途徑并不是獨立的，與初級代謝途徑有密切關系，是它的延伸或支路。定義產(chǎn)物合成期能使營養(yǎng)物質轉換成細胞結構物質、維持微生物正常生命活動的生理活性物質或能量的代謝。為了避免在初級代謝過程中某些中間產(chǎn)物積累所造成的不利作用而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型。生長繁殖所必需，如氨基酸、核苷酸、維生素，酶、輔酶非生長繁殖必需，如抗生素、毒素、甾體化合物等隨菌體生長不斷的合成通常在細胞生長后期形成第五十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選例：如何從缺陷型菌種中篩選能夠積累C的高產(chǎn)菌株？思路：了解涉及C這種物質在菌體中的代謝途徑ABCDE(i)C為中間產(chǎn)物，正常途徑不可能積累；兩個結論：(ii)E為終產(chǎn)物，生長必需；第五十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選思路：分析積累C在代謝途徑中的可能性(ii)切斷C→D，代謝終止，終產(chǎn)物E不能繼續(xù)合成；(i)若要積累C，必須切斷C→D的代謝；(iii)E生長必需，若不能合成，菌體無法生存；ABCDE小結：若想達到既能累積C，又能保持菌體不斷生長的目的，可在切斷C→D之后，人工添加E。(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)第五十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)思路：分析積累C在代謝途徑中的可能性生物反應具有一個特點：ABCDE反饋抑制現(xiàn)象也就是說，即使C→D切斷后，C的積累量也不可能很多；而E的添加量也不能很大解決方案總的原則：繞過反饋抑制第五十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)解決方案篩選類型思路方法原理初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選需要繞過反饋調節(jié)a.降低終產(chǎn)物濃度b.篩選抗反饋突變菌株c.控制細胞膜滲透性利用營養(yǎng)缺陷型積累中間代謝物，采用低濃度終產(chǎn)物供給在含有抗代謝物（結構類似物）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選抗性突變株，其中一些可分泌大量末端產(chǎn)物通過生理學或遺傳學方法，改變膜透性，使胞內(nèi)代謝物迅速滲漏到胞外，解除反饋抑制第五十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選結構類似物：在化學和空間結構上與代謝中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質。第五十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)具體操作兩種方法：(i)將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，洗滌培養(yǎng)基，制備成細胞懸液后，與MM培養(yǎng)基（融化并涼至50℃）混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5~6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組織營養(yǎng)物的濾紙圓片，培養(yǎng)后若在組合區(qū)長出，就可測得營養(yǎng)缺陷類型。第六十頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)具體操作兩種方法：(ii)以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于相應位置，培養(yǎng)后根據(jù)菌種在什么組合長出可推知其營養(yǎng)缺陷類型。第六十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)例：黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的篩選(i)Thr、Lys生長繁殖必需；(ii)Thr和Lys共同反饋抑制ASP激酶；(iii)Lys反饋抑制雙氫吡啶合成酶；第六十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)例：黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的篩選思路：(i)切斷天冬氨酸半醛→高絲氨酸途徑，并低濃度添加Thr；(ii)篩選Lys的抗反饋突變菌株；第六十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)例：黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的篩選操作：(i)篩選Thr營養(yǎng)缺陷性菌株；(ii)在培養(yǎng)基中加入Lys的結構類似物AEC，篩選生長旺盛的抗反饋突變菌株；第六十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產(chǎn)品鑒定)例：黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制結果：誘變菌株名稱缺陷型Lys產(chǎn)量（g/L）As1.495Leu-2.1F6-16Leu-，Thr-20.8F9-50Leu-，Thr-，AECr33.5第六十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良二、生產(chǎn)菌種的改良方法有3種：雜交育種、原生質體融合以及DNA重組改良方式定義優(yōu)勢雜交育種常規(guī)雜交育種原生質體融合將兩個基因型不同的菌株經(jīng)細胞的互相聯(lián)結或原生質體融合使遺傳性狀會出現(xiàn)重新組合，然后經(jīng)分離和篩選，獲得符合要求的生產(chǎn)菌株?？朔芯N生活力衰退的趨勢；遺傳物質重新組合，菌種對誘變劑更為敏感。二親株的細胞質和細胞核進行合二為一的過程，因此遺傳物質的交換更為完整，提高菌株產(chǎn)量的潛力更大。第六十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良二、生產(chǎn)菌種的改良方法有3種：雜交育種、原生質體融合以及DNA重組改良方式定義優(yōu)勢DNA重組是一個將含目的基因DNA片段經(jīng)體外操作與載體連接，轉入一個受體細胞并使之擴增、表達的過程。更有目的性和方向性，效率更高。第六十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良二、生產(chǎn)菌種的改良DNA重組過程(a)目的基因的獲得；(b)載體的選擇；(c)含目的基因的DNA片段克隆入載體中構成重組載體；(d)將重組載體引入宿主細胞內(nèi)進行復制、擴增；(e)篩選出帶有重組目的基因的轉化細胞；(f)鑒定外源基因的表達產(chǎn)物；第六十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日目的基因的獲得一般有四條途徑：(i)從生物細胞中提取、純化染色體DNA并經(jīng)適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶部分酶切；(ii)經(jīng)反轉錄酶的作用由mRNA在體外合成互補DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及動，植物細胞中特定基因的克?。?iii)化學合成，主要用于那些結構簡單、核苷酸順序清楚的基因的克??；(iv)從基因庫中篩選、擴增獲得，目前認為是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。第六十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日載體的選擇基因工程中所用的載體系統(tǒng)主要有各種質粒（細菌質粒、粘性質粒、酵母菌質粒）、λ噬菌體以及動物病毒等。載體一般為環(huán)狀DNA，能在體外經(jīng)限制酶及DNA連接酶的作用同目的基因結合成環(huán)狀DNA質粒pBR322第七十頁，共九十六頁，2022年，8月28日重組載體DNA體外重組是將目的基因用DNA連接酶連接到合適的載體DNA上，可采用粘端連接法和末端連接法。第七十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日引入宿主質粒為載體的重組DNA以轉化方式進入宿主細胞；以噬菌體為載體以轉染方式進入；柯斯質粒以轉導方式進入。第七十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日篩選轉化細胞根據(jù)導入基因的表達產(chǎn)物來篩選。轉化子能在氨芐青霉素及四環(huán)素培養(yǎng)基中生長轉化子只能在氨芐青霉素培養(yǎng)基中生長第七十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日基因工程菌的獲得經(jīng)重組DNA的轉化與鑒定，得到符合“設計藍圖”的工程菌。第七十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良二、生產(chǎn)菌種的改良DNA重組實例：天冬酰胺酶II在大腸桿菌中的高效表達(i)宿主的選擇：大腸桿菌菌株DH5α

(ii)目的基因的選擇：EC-II的基因ansB序列是已知的，通過基因庫可以查到。(iii)載體的選擇：高效原核表達載體pBV220(iv)引物的設計：P1:5’-GGAATTCCATGTTACCCAATATCACCATT-3’P2:5’-CGGATCCGATGGACGTGAGTCTG-3’第七十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良二、生產(chǎn)菌種的改良DNA重組實例：天冬酰胺酶II在大腸桿菌中的高效表達(v)ansB的PCR擴增：PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃變性1min、55℃復性1min、72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后一個循環(huán)，72℃延伸5min。(vi)重組載體的構建：將載體pBV220與ansB通過T4連接酶連接，得到pBV-EC；(vii)引入宿主細胞：將重組表達質粒pBV-EC轉化進大腸桿菌DH5α，得到重組表達菌株DH5α/pBV-EC，第七十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育與改良二、生產(chǎn)菌種的改良DNA重組實例：天冬酰胺酶II在大腸桿菌中的高效表達(viii)菌種的篩選與鑒定：高效原核表達載體pBV220本身帶有抗氨芐的基因，而DH5α本身不抗氨芐。如果載體轉入菌中，那么它也就帶了抗氨芐的基因。在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上就能生長，未轉入的就不行。第七十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

一、菌種發(fā)生衰退的現(xiàn)象1.定義菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失稱為菌種的退化。2.現(xiàn)象①菌落形態(tài)、細胞形態(tài)和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細胞的出現(xiàn)等；②菌株生長變得緩慢，產(chǎn)孢子越來越少直至產(chǎn)孢子能力喪失；③菌種的代謝活動，代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降。第七十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

二、菌種發(fā)生衰退的原因1.根本原因菌種退化的根本原因是有關基因的負突變。2.直接原因①一般而言，菌種的退化是一個從量變到質變逐步演變的過程。因此，突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代。②連續(xù)傳代，使得菌種經(jīng)常處于旺盛的生長狀態(tài)，而細胞的代謝水平與基因突變關系密切，因此其發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細胞大得多。菌種的連續(xù)傳代。第七十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發(fā)生退化的措施1.菌種分離使用單細胞分離的方法，從退化的菌株中篩選出性能優(yōu)良的單細胞菌落。2.菌種的復壯分為廣義的和狹義兩種復壯。狹義的復壯就是對衰退菌種的分離，屬于被動措施；廣義的復壯則是在菌種尚未衰退之前就有意識的進行純種分離和生產(chǎn)性能的測定，篩選正突變的菌種，屬于積極的措施。第八十頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發(fā)生退化的措施2.菌種的復壯復壯方法：(a)純種分離(b)通過寄主進行復壯如殺螟桿菌(c)淘汰已衰退個體如5406菌種3.提供良好的環(huán)境條件(a)選用合適的培養(yǎng)基(b)控制傳代次數(shù)第八十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發(fā)生退化的措施4.優(yōu)良的保藏方法(1)保藏方法：斜面冰箱保存法、砂土管保存法、真空冷凍干燥保存法、干孢子保存法、液氮超低溫保藏法等(2)保藏原理：用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑或酸度中和劑等方法，挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體，使微生物生長在代謝不活潑，生長受抑制的環(huán)境中。第八十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發(fā)生退化的措施4.優(yōu)良的保藏方法(3)菌種保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM)成立普通、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學、抗生素和獸醫(yī)等微生物學有關的六個菌種保藏管理中心普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)中國科學院微生物研究所，北京(AS)：真菌、細菌。

中國科學院武漢病毒研究所，武漢(AS-IV)：病毒。農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，北京(ISF)第八十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發(fā)生退化的措施4.優(yōu)良的保藏方法(3)菌種保藏機構：工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)中國食品發(fā)酵工業(yè)科學研究所，北京(IFFI)醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京(ID)：真菌。

衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所，北京(NICPBP)：細菌

中國醫(yī)學科學院病毒研究所，北京(IV)：病毒。第八十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發(fā)生退化的措施4.優(yōu)良的保藏方法(3)菌種保藏機構：抗生素菌種保藏管理中心(CACC)

中國醫(yī)學科學院抗菌素研究所，北京(IA)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都(SIA)華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊(IANP)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC

農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京(CIVBP)第八十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發(fā)生退化的措施4.優(yōu)良的保藏方法(3)菌種保藏機構：國外著名菌種保藏機構

美國標準菌種收藏所(ATCC)，美國馬里蘭州

冷泉港研究室(CSH)，美國紐約

國立衛(wèi)生研究院(NIH)，美國馬里蘭州

國立標準菌種收藏所(NCTC)，英國倫敦

日本東京大學應用微生物研究所(IAM)，日本東京

發(fā)酵研究所(IFO)，日本大阪世界衛(wèi)生組織(WHO)第八十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日第四節(jié)種子