第三節(jié)動物細胞工程

第三節(jié)動物細胞工程演示文稿第一頁，共三十八頁。優(yōu)選第三節(jié)動物細胞工程第二頁，共三十八頁。2動物細胞培養(yǎng)定義動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。是動物細胞工程的基礎(chǔ)。第三頁，共三十八頁。3發(fā)展歷史1907，美國的哈里森使用蓋玻片懸滴培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織細胞第四頁，共三十八頁。4生長特性貼附生長型如人胚肺細胞，Hela細胞，巨噬細胞，神經(jīng)細胞懸浮生長型細胞如血液白細胞，淋巴組織細胞等第五頁，共三十八頁。5體外培養(yǎng)細胞基本技術(shù)體外培養(yǎng)特點體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)條件體外細胞生長增殖過程培養(yǎng)方法大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)第六頁，共三十八頁。5.1體外培養(yǎng)特點營養(yǎng)條件苛刻適應(yīng)性差,敏感培養(yǎng)時間長，易污染第七頁，共三十八頁。培養(yǎng)工具器皿為各種類型的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)室、小室等載體：空心纖維和微珠第八頁，共三十八頁。5.2體外培養(yǎng)工具空心纖維微球第九頁，共三十八頁。5.3體外培養(yǎng)條件溫度，37度pH：氣體，氧，二氧化碳，氮氣營養(yǎng)條件需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供第十頁，共三十八頁。動物細胞培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：主要有血清，組織提取液、雞胚汁合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基第十一頁，共三十八頁。動物細胞培養(yǎng)必需的溶液平衡鹽水培養(yǎng)基pH細胞消化液：把組織解離成分散細胞胰蛋白酶消化液和EDTA溶液抗生素溶液第十二頁，共三十八頁。

5.4體外細胞生長增殖過程原代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期衰退期第十三頁，共三十八頁。5.5培養(yǎng)方法懸滴：最早由Harrison1907年創(chuàng)立旋轉(zhuǎn)管：灌注小室培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板第十四頁，共三十八頁。原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù)1）組織快培養(yǎng)首先從機體獲得組織快，然后放入一個培養(yǎng)皿中用Hanks液洗，用小剪刀剪成1mm3的組織快，加入少許培養(yǎng)液，塞上瓶塞置于37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，成單層后做傳代培養(yǎng)。為促進細胞帖壁，也可以瓶內(nèi)壁涂一層血清。第十五頁，共三十八頁。組織消化培養(yǎng)過程取材分離和組織消化培養(yǎng)過程接種、培養(yǎng)-常規(guī)檢查第十六頁，共三十八頁。傳代培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，細胞分裂增殖擴展成片，占滿器皿表面。這時需要對其分離培養(yǎng)，這一操作過程稱為傳代。（1）吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。（2）加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底。（3）2-5min后檢查，如有細胞間隙變大或細胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，終止消化。（4）吸出消化液，加入Hanks液。（5）用吸管輕打瓶壁，使細胞脫落成懸浮液（6）重新接種第十七頁，共三十八頁。貼壁培養(yǎng)技術(shù)貼壁培養(yǎng)的材料：1）玻璃2）塑料

3）金屬

4）微載體第十八頁，共三十八頁。基本操作1）將培養(yǎng)材料用物理或生物化學(xué)法分散成細胞懸浮液。2）過濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。3）放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第十九頁，共三十八頁。生長過程及優(yōu)點游離期吸附期繁殖期退化期優(yōu)點：1）貼壁培養(yǎng)比較容易更換培養(yǎng)基2）容易采用灌注培養(yǎng)，提高細胞密度。3）更有效表達同一產(chǎn)品。4）方便地調(diào)節(jié)培養(yǎng)液和細胞比例。5）易于觀察細胞生長狀況。第二十頁，共三十八頁。5.6大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)懸液培養(yǎng)，使用微球載體微載體培養(yǎng)多孔載體培養(yǎng)微囊化培養(yǎng)中空纖維法第二十一頁，共三十八頁。動物細胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器種類：微載體式中空纖維式：最經(jīng)典，最常用灌注培養(yǎng)式旋轉(zhuǎn)壁式第二十二頁，共三十八頁。6動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用1962年開始，用于生物醫(yī)學(xué)研究，生產(chǎn)酶制劑，生長因子，疫苗，單抗等，酶類，激素，病毒殺蟲劑（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（2）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。（3）用于檢測有毒物質(zhì)（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)第二十三頁，共三十八頁。動物細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液中通常含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等第二十四頁，共三十八頁。動物細胞動物細胞原代培養(yǎng)分裂10次細胞株傳代培養(yǎng)分裂50次(細胞系)(細胞株)細胞系無限分裂遺傳物質(zhì)未發(fā)生改變遺傳物質(zhì)發(fā)生改變無限增值第二十五頁，共三十八頁。植物體培養(yǎng)結(jié)果獲得細胞或細胞分泌蛋白培養(yǎng)目的葡萄糖動物血清蔗糖植物激素液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞增殖細胞的全能性原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目細胞株、細胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果分泌蛋白快速繁殖、培育無病毒植株培養(yǎng)目的葡萄糖動物血蔗糖植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞增殖細胞的全能性原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目植物細胞和動物細胞培養(yǎng)的比較第二十六頁，共三十八頁。動物細胞融合第二十七頁，共三十八頁。誘導(dǎo)動物細胞融合的方法物理法：離心、振動、電刺激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）生物法：滅活的動物病毒動物細胞融合的用途制備單克隆抗體第二十八頁，共三十八頁。主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性細胞融合的原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目比較項目植物、動物細胞融合的比較第二十九頁，共三十八頁。采用此方法可以將兩個不同種、屬的動物優(yōu)點集中在一起，產(chǎn)生具有雙親優(yōu)點的可繁殖的雜種動物。細胞核移植對動物優(yōu)良雜交種的無性繁殖具有重大意義。這一技術(shù)的成功與完善對于優(yōu)良家禽的無性繁殖和瀕臨絕跡的珍貴動物的傳種意義重大。第三十頁，共三十八頁。Vero細胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應(yīng)器接種狂犬病毒出液口收獲病毒第三十一頁，共三十八頁。6.1單克隆抗體

1975年英國科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細胞同腫瘤細胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。

第三十二頁，共三十八頁。每個B淋巴細胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細胞可以無限增殖，因此雜交瘤細胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。

單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。第三十三頁，共三十八頁。（1）提出問題：從動物血清中分離抗體的方法產(chǎn)量低、特異性差、純度低、反應(yīng)不夠靈敏（2）設(shè)計方案：由于每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，利用單個B淋巴細胞進行無性繁殖，就可以產(chǎn)生單克隆抗體。由于B淋巴細胞不能無限增殖，因此利用小鼠骨髓瘤細胞與之融合，就可達到目的。第三十四頁，共三十八頁。雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖第三十五頁，共三十八頁。單克隆抗體的應(yīng)用①在基礎(chǔ)理論研究中具有重要意義②在疾病診斷、治療和預(yù)防方面，具有特異性高、靈敏度高等優(yōu)越性。③生物導(dǎo)彈第三十六頁，共三十八頁。組織工程應(yīng)用細胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，將人體某部分的組織細胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進行人工培養(yǎng)繁殖，擴增，然后移植到人體內(nèi)所需的部位，從而達到器官修復(fù)或再造的治療目的。第三十七頁，共三十八頁。6.2

動物克隆

生物繁殖后代通常是以精、卵細胞結(jié)合的有性生殖方式進行。通過營養(yǎng)體細胞繁殖個體的方法稱為無性繁殖。克隆是指離體條件下的無性繁殖。1981年Illmenses率先報告用小鼠幼胚細胞核克隆出正常小鼠。隨后，1984年Willadsen用未成熟羊胚細胞核克隆出一頭羊。

英國PPI生物技術(shù)的羅斯林（Roslin）研究所的維爾穆特(Wilmut)博