儀器教學(xué)：從基因組到蛋白質(zhì)組09410課件

儀器分析教學(xué)從基因組到蛋白質(zhì)組

2009.4.10.內(nèi)容提要一.人類(lèi)基因組研究的意義二.人類(lèi)基因組研究的現(xiàn)狀三.蛋白質(zhì)組研究的意義和前景四.蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線(xiàn)一.人類(lèi)基因組研究的意義1986年美藉意大利科學(xué)家提出進(jìn)行全基因分析，以尋找與正常人基因不同的腫瘤基因。1990年美國(guó)能源部和國(guó)立衛(wèi)生研究院集中一批優(yōu)秀的科學(xué)家準(zhǔn)備投資30億美元進(jìn)行為期15年的人類(lèi)基因組研究計(jì)劃，對(duì)人類(lèi)基因組作圖和序列分析。希望在分子水平上破譯人類(lèi)所有的遺傳信息，即測(cè)定大約30億堿基對(duì)DNA序列和識(shí)別其中所有的基因（約10萬(wàn),5萬(wàn)，4萬(wàn)，3萬(wàn)）。二.人類(lèi)基因組研究現(xiàn)狀我國(guó)在人類(lèi)基因組研究方面取得了顯著進(jìn)展:1、湖南醫(yī)科大學(xué)夏家輝等:家族性耳聾基因分析.NatureGenetics1998.20(4):370-3932、上海第二醫(yī)科大學(xué)陳竺等：白血病相關(guān)基因分析3、上海腫瘤所顧健人等:肝癌相關(guān)基因分析4、中科院昆明生物所褚家佑等:中華民族基因關(guān)系分析PNAS1998;95:11763研究現(xiàn)狀5、復(fù)旦大學(xué)遺傳所人類(lèi)基因研究方面:發(fā)現(xiàn)新基因2500確定功能的新基因250條申請(qǐng)專(zhuān)利200項(xiàng)疾病相關(guān)基因分析Genomics6、中科院遺傳所人類(lèi)基因研究中心:注冊(cè)承擔(dān)30Mb，占全部基因的1％，2000.3.完成。7、國(guó)家科技部人類(lèi)基因研究南方中心，北方中心:希望完成1000條基因,占全部的1％.8、其它。微生物基因組學(xué)研究1、痢疾桿菌全基因組測(cè)序北京病毒所金奇教授課題組2、表皮葡萄球菌全基因組測(cè)序上海醫(yī)科大學(xué)聞?dòng)衩吩菏空n題組人類(lèi)個(gè)體化全基因組學(xué)研究1、西方白種人2、東方黃種人3、非洲黑種人三.蛋白質(zhì)組研究的意義和前景（一）蛋白質(zhì)組學(xué)的概念（二）基因組和蛋白質(zhì)組的比較（三）意義和前景WhatisaProteome?TheentirePROTEinpopulationexpressedbythegenOMEofaparticularcellortissuetype.Whyareproteinsimportant?Thegenomesequencemaybetheblueprintofacell,butproteinsarethemajorbuildingblocks.（二）基因組分析和蛋白質(zhì)組分析的比較

基因組蛋白質(zhì)組

組成4種堿基20種氨基酸；翻譯后加工組分不變動(dòng)態(tài)變化：不同細(xì)胞；不同時(shí)空.分布定位于染色體分布于整個(gè)細(xì)胞測(cè)序方法簡(jiǎn)單，已完善復(fù)雜：N末端已完善C末端，發(fā)展中2、蛋白質(zhì)組研究的數(shù)據(jù)與基因組數(shù)據(jù)的整合，將會(huì)在后基因組（post-genome)研究－基因組功能研究上發(fā)揮重要作用。因此，蛋白質(zhì)組研究可取得十分豐富的數(shù)據(jù)資料，能進(jìn)一步帶動(dòng)生物信息學(xué)等現(xiàn)代邊緣學(xué)科的發(fā)展；同時(shí)，也推動(dòng)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。3、我國(guó)目前提出人類(lèi)重要疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，集中在蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)變化的功能蛋白質(zhì)組研究上，越過(guò)總蛋白質(zhì)組中“全部”這一難點(diǎn)，更具實(shí)踐意義。在研究許多功能蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)上綜合起來(lái)，就能描繪出接近于“全體蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)組。

四.蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線(xiàn)（一）不同結(jié)構(gòu)層次的分離（二）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)（三）質(zhì)譜分析相關(guān)的技術(shù)（一）不同結(jié)構(gòu)層次的分離以闡明基因組功能為目的，蛋白質(zhì)組研究必須獲得這樣的信息：細(xì)胞、組織或有機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類(lèi)，翻譯后修飾，分布，表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量等。為此，蛋白質(zhì)組分析首先要求分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞或組織等不同生命結(jié)構(gòu)層次的蛋白質(zhì)。1、超速離心機(jī)分離方法貝克曼超速冷凍離心機(jī)

主要性能：最高轉(zhuǎn)速80000RPM;最大離心力51500g；可調(diào)溫度范圍-3040攝氏度；備有不同定角轉(zhuǎn)頭，分別適用于10ml，50ml，250ml體積樣品的分離和提取。

主要功能及應(yīng)用范圍：廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)等研究領(lǐng)域的樣品提取和分離；用于生物體細(xì)胞中的核酸，蛋白，酶等的提取和分離；也可用于對(duì)所研究的對(duì)象如生物細(xì)胞，細(xì)菌，血清，蛋白等有機(jī)物或無(wú)機(jī)物的乳濁液，懸浮液，膠體樣品進(jìn)行分離，提取，濃縮等制備工作。

蛋白質(zhì)分析鑒定的基本要求（一〕檢查指標(biāo)分析方法鑒定標(biāo)準(zhǔn)

分子量SDS－PAGE電泳銀染色一條帶符合設(shè)計(jì)要求指標(biāo)等電點(diǎn)等電聚焦電泳電泳銀染色一條帶，掃描95％以上濃度紫外分光光度法濃度(mg/ml)＝1.45OD280-0.74OD260純度HPLC（或FPLC）層析一個(gè)峰（95％）WesternBlot有一條活性蛋白帶

蛋白質(zhì)分析鑒定的基本要求（二）檢查指標(biāo)分析方法鑒定指標(biāo)

生物學(xué)活性細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)符合國(guó)際規(guī)定的比活性和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)特定生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)結(jié)構(gòu)分析氨基酸組成分析各種氨基酸組分比例符合預(yù)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列分析N－末端15個(gè)氨基酸符合要求肽譜圖符合定點(diǎn)降解（二）蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)：

1.雙向電泳技術(shù)2.蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析3.蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析4.肽譜分析5.微量測(cè)序（二）蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)

1.雙向電泳技術(shù)2.蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析3.蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析4.肽譜分析5.微量測(cè)序蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本過(guò)程樣品2-DPAGE成像分析蛋白質(zhì)膠上酶解或膜轉(zhuǎn)移等方法提取蛋白質(zhì)或多肽混合物質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量及部分序列Edman降解N-terminal序列Databasesearching鑒定蛋白質(zhì)1、雙向凝膠電泳（2－D）雙向凝膠電泳的基本原理是蛋白質(zhì)首先根據(jù)其等電點(diǎn)在pH梯度膠中等電聚焦，然后按照它們的分子量大小進(jìn)行SDS－PAGE第二次電泳分離。蛋白質(zhì)組研究通常需要對(duì)雙向電泳分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。一種細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)組雙向電泳后可分離到幾千甚至上萬(wàn)種蛋白質(zhì)，一般對(duì)它們采取分級(jí)鑒定，即先用快速、低廉的方法，再采用耗時(shí)、耗資的方法去鑒定蛋白質(zhì)。2、蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析

氨基酸組成分析由于耗資低而常用于蛋白質(zhì)鑒定。組成分析對(duì)雜質(zhì)污染較敏感。通過(guò)組分分析，可得到某一種蛋白質(zhì)中所含各種氨基酸的比例。3、蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析

Edman降解法測(cè)定的蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列非常準(zhǔn)確，但每次只能測(cè)定從N端起1－15個(gè)氨基酸。一個(gè)大的蛋白質(zhì)分子往往含有多于100個(gè)以上的氨基酸。因此需要進(jìn)一步進(jìn)行肽譜分析。4、肽譜分析

對(duì)于大于100個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)需要化學(xué)方法（如CNBr）或生物學(xué)方法（酶解）將肽鏈斷裂成不同短肽，測(cè)序后進(jìn)行拼接而構(gòu)成完整的序列。5、微量測(cè)序

在Edman降解的基礎(chǔ)上，目前已實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)微量測(cè)序的自動(dòng)化。首先使凝膠分離的蛋白質(zhì)直接轉(zhuǎn)印到PVDF膜或玻璃纖維膜上，考馬斯亮蘭染色，甲醇－冰乙酸脫色，直接將印跡有蛋白質(zhì)的PVDF斑點(diǎn)塊或條帶，剪切下來(lái)，置于蛋白質(zhì)測(cè)序儀中，可用于極微量水平蛋白質(zhì)的鑒定。

蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的分析

蛋白樣品SDS－PAGE轉(zhuǎn)移到NC，PVDFWesternBlot陽(yáng)性條帶考馬斯亮藍(lán)R250染色對(duì)應(yīng)條帶甲醇脫色測(cè)序PSAPGLPVGT抗原抗體免疫反應(yīng)的高度特異性PVDF膜作載體測(cè)序的高度敏感性

對(duì)于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的分析和基因工程表達(dá)產(chǎn)物的快速鑒定，蛋白質(zhì)組學(xué)中極微量蛋白分析提供一個(gè)特別有用的新手段。相結(jié)合（三）與質(zhì)譜分析相關(guān)的技術(shù)

質(zhì)譜分析已成為連接蛋白質(zhì)與基因的重要技術(shù)，開(kāi)啟了大規(guī)模自動(dòng)化的蛋白質(zhì)鑒定大門(mén)。目前質(zhì)譜廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)的純度鑒定、分子量測(cè)定、序列測(cè)定、肽譜分析、二硫鍵、乙酰化、糖基化、磷?；?，以及非共價(jià)鍵結(jié)合等研究中。質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)原理，使氣體分子產(chǎn)生帶正電荷的離子，并按離子的質(zhì)荷比將它們分離，同時(shí)記錄和顯示這些離子的相對(duì)強(qiáng)度的一種儀器。質(zhì)譜法(MassSpectroscopy,MS)一般采用高速電子束撞擊氣態(tài)分子，將分解出的陽(yáng)離子加速導(dǎo)入質(zhì)量分析器中，然后按質(zhì)荷比(m/e)的大小順序進(jìn)行收集和記錄下來(lái)，即得到質(zhì)譜圖。根據(jù)質(zhì)譜圖峰的位置，可以進(jìn)行定性和結(jié)構(gòu)分析；根據(jù)峰的強(qiáng)度，可以進(jìn)行定量分析。一、異煙肼耐藥菌株和敏感菌株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)7H9Broth細(xì)菌壁蛋白的制備雙向電泳考馬斯亮藍(lán)染色或銀染MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索耐異煙肼菌株細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜結(jié)核桿菌H37Rv株細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜異煙肼耐藥菌株和敏感菌株的差異蛋白分析質(zhì)譜分析鑒定的6個(gè)差異蛋白

蛋白質(zhì)名稱(chēng)分子量/等電點(diǎn)可比度（％）1、海藻糖磷酸磷酸酶45888/5.343%2、鐵鉬蛋白A41721/8.725%3、莽草酸脫氫酶28746/6.243%4、葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶67503/5.430%5、吲哚-3-甘油磷酸合成酶28146/5.234%6、TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子24999/5.637%

1.莽草酸脫氫酶Rv2552c,aroE2.鐵鉬蛋白R(shí)v3109，moaA3.海藻糖磷酸磷酸酶Rv2006，otsB4.葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶Rv3436c,gimS5.吲哚－3－甘油磷酸合成酶Rv1611，trpC6.TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rv25066個(gè)差異表達(dá)蛋白及基因編號(hào)

蛋白質(zhì)名稱(chēng)分子量/等電點(diǎn)可比度(％)基因信息1.海藻糖磷酸磷酸酶45888/5.343%Rv2006，otsB2.鐵鉬蛋白A41721/8.725%Rv3109，moaA3.莽草酸脫氫酶28746/6.243%Rv2552c,aroE4.葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶67503/5.430%Rv3436c,gimS5.吲哚-3-甘油磷酸合成酶28146/5.234%Rv1611，trpC6.TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子24999/5.637%Rv2506樣品制備（菌體蛋白）雙向電泳數(shù)據(jù)庫(kù)搜索蛋白質(zhì)鑒定PMF樣品制備

MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測(cè)三、利福平耐藥菌株和敏感菌株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)凝膠圖象分析利福平耐藥菌株菌體蛋白比較蛋白質(zhì)組分析pH:47—66.2KDa—43.0KDa—31.0KDa—