第三章-組織培養(yǎng)

第三章__組織培養(yǎng)第三章

園林植物苗木培育技術(shù)3.4組織培養(yǎng)育苗植物組織培養(yǎng)：根據(jù)植物細胞的全能性原理，將植物的器官、組織、細胞，接種到人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下，進行離體培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。試管苗植物組織培養(yǎng)技術(shù)的實用性特點（1）植株組培快繁、周期短、節(jié)省材料（2）應用廣泛植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（1）實驗室洗滌室稱量室植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（1）實驗室培養(yǎng)基制備室滅菌室植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（1）實驗室接種室緩沖室植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（1）實驗室培養(yǎng)室植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（1）實驗室培養(yǎng)室準備室滅菌室儲藏室接種室緩沖室植物組織培養(yǎng)實驗室布局示意圖為了減少污染，實驗室最好設一走廊且走廊上方最好安裝紫外燈；培養(yǎng)室最好設在南面，設大玻璃窗，以雙層玻璃窗為最好。如果培養(yǎng)室是設在房屋的邊側(cè)，其東邊或西邊的墻上也可設置大玻璃窗；培養(yǎng)室房間及門要小，而且密閉性要好，最好裝移門；無菌操作室要小，要設緩沖間，也最好裝移門，且門要稍大一些。植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（2）儀器設備和用具酸度計細菌過濾器超凈工作臺植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（2）儀器設備和用具高壓蒸汽滅菌鍋植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（2）儀器設備和用具植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（2）儀器設備和用具植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)1）基本條件（3）培養(yǎng)容器植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)2）操作技術(shù)（1）玻璃器皿洗滌植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)2）操作技術(shù)（2）培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的重要性基本培養(yǎng)基：指只含有維持離體植物細胞基本生命活動所需的營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基。通常包括水分、無機營養(yǎng)成分和有機營養(yǎng)成分，不包括激素和天然有機附加物。完全培養(yǎng)基：指在基本培養(yǎng)基的基礎上另外附加激素或天然有機附加物所組成的培養(yǎng)基。①培養(yǎng)基的構(gòu)成培養(yǎng)基水無機鹽類有機營養(yǎng)大量元素化合物微量元素化合物氨基酸類糖類維生素類植物生長調(diào)節(jié)劑生長素類細胞分裂素類凝固劑組織培養(yǎng)時，植物激素的使用規(guī)律在生長素存在的條件下，細胞分裂素的作用有加強的趨勢，但二者在使用上有一定的順序關(guān)系，處理順序不同，培養(yǎng)物的分化狀態(tài)也不同。規(guī)律如下：⑴先用生長素處理，后用細胞分裂素處理，有利于細胞分裂，但細胞不容易分化，容易產(chǎn)生多倍體細胞。⑵先用細胞分裂素處理，后用生長素處理，細胞分裂也分化。⑶用生長素和細胞分裂素同時處理，細胞脫分化后分化頻率提高。但二者的使用濃度比值可以決定器官分化方向：生長素/細胞分裂素比值高時，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值適中時，促進愈傷組織的形成和生長。高無機鹽含量的培養(yǎng)基代表類型：MS，LS，BL，ER硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基代表類型：B5，N6，SH中等無機鹽含量的培養(yǎng)基代表類型：Nitsch，Miller低無機鹽含量的培養(yǎng)基代表類型：White，WS，HE②培養(yǎng)基的配方成分使用濃度(mg/L)成分使用濃度(mg/L)硝酸鉀（KNO3）1900碘化鉀（KI）0.83硝酸銨（NH4NO3）1650硼酸（H3BO3）6.2磷酸二氫鉀（KH2PO4）170硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）8.6硫酸鎂（MgSO4·7H2O）370鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）0.25氯化鈣（CaCl2·2H2O）440硫酸銅（CuSO4·5H2O）0.025硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）27.8氯化鈷（CoCl2·6H2O）0.025硫酸錳（MnSO4·4H2O）22.3甘氨酸2乙二胺四乙酸二鈉（Na2·EDTA）37.3鹽酸硫胺素（VB1）0.1肌醇100鹽酸吡哆醇（VB6）0.5蔗糖30000煙酸（VB5或VPP）0.5瓊脂7000MS培養(yǎng)基配方

成分使用濃度(mg/L)成分使用濃度(mg/L)硝酸鉀（KNO3）2500碘化鉀（KI）0.75硫酸銨（（NH4）2SO4）134硼酸（H3BO3）3.0磷酸二氫鉀（KH2PO4）150硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）2.0硫酸鎂（MgSO4·7H2O）250鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）0.25氯化鈣（CaCl2·2H2O）150硫酸銅（CuSO4·5H2O）0.025硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）27.8氯化鈷（CoCl2·6H2O）0.025硫酸錳（MnSO4·4H2O）10鹽酸硫胺素（VB1）10乙二胺四乙酸二鈉（Na2·EDTA）37.3鹽酸吡哆醇（VB6）1.0肌醇100煙酸（VB5或VPP）1.0蔗糖20000瓊脂7000B5培養(yǎng)基配方

成分使用濃度(mg/L)成分使用濃度(mg/L)硝酸鉀（KNO3）80硫酸錳（MnSO4·4H2O）7氯化鉀（KCl）65硼酸（H3BO3）1.5硝酸鈣（Ca(NO3)2·4H2O300硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）3硫酸鎂（MgSO4·7H2O）720

硫酸鐵（Fe(SO4)3）

2.5碘化鉀（KI）0.75鹽酸硫胺素（VB1）

0.1硫酸鈉（NaSO4）200鹽酸吡哆醇（VB6）

0.1磷酸氫鈉（NaH2PO4·H2O）

16.5煙酸（VB5或VPP）0.5甘氨酸3蔗糖20000White培養(yǎng)基配方

基本培養(yǎng)基母液的配制⑴單配法⑵混配法①按照避免難溶性沉淀形成的原則和物質(zhì)種類的不同，將基本培養(yǎng)基配方所包括的物質(zhì)進行分組②基本培養(yǎng)基配方中物質(zhì)劃分組數(shù)的多少，即配制母液數(shù)的多少可根據(jù)實際情況而定，如MS培養(yǎng)基可以配制三液式、四液式、五液式等例如：MS培養(yǎng)基五液式大量元素母液鈣鹽母液微量元素母液鐵鹽母液有機營養(yǎng)成分母液植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù)2）操作技術(shù)（3）外植體消毒、接種接種：把處理好的材料經(jīng)無菌操作程序放置到培養(yǎng)基上，這一過程外植體器皿和器具的洗滌洗滌劑：無磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗潔精常用清洗方法：洗滌劑清洗法、超聲波清洗法

①消毒——器皿消毒器具的滅菌方法①消毒——器皿消毒干熱滅菌法高壓蒸汽滅菌法（濕熱滅菌法）火焰灼燒滅菌法高溫蒸汽滅菌法①消毒——培養(yǎng)基消毒培養(yǎng)基濕熱滅菌最少時間液體容積（ml）121℃所需時間（min）20---50157520250---500251000301500---200035---40培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）操作滅菌后培養(yǎng)基的存放：鍋內(nèi)加水放入消毒桶裝入培養(yǎng)基蓋好鍋蓋接通電源加熱排盡鍋內(nèi)冷空氣達到滅菌溫度時開始計時并保持足夠長的時間繼續(xù)加熱切斷電源壓力表指針歸零時打開鍋蓋取出培養(yǎng)基并存放好高壓蒸汽滅菌鍋安全使用注意事項：①滅菌前外層鍋內(nèi)要加入足夠的水,滅菌完成后要將鍋內(nèi)的水排放干凈。②在滅菌過程中及滅菌后，壓力表壓力指針歸零之前,不能打開鍋蓋,以免發(fā)生危險。③注意日常維護和檢查,及時發(fā)現(xiàn)問題,及時修理，保證使用安全可靠。使用高壓蒸汽滅菌鍋進行物品滅菌時的注意事項：①消毒鍋內(nèi)放置的物品要有一定的縫隙，便于高溫蒸汽上下回流，達到良好滅菌效果。②鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡，否則壓力表的指針雖然達到了規(guī)定的壓力，但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在，并不能達到相應的溫度，因而影響滅菌效果。③進行培養(yǎng)基滅菌時，鍋內(nèi)達到規(guī)定的滅菌溫度后，在嚴格保持滅菌溫度的同時，還要嚴格保持滅菌時間。時間過長會破壞培養(yǎng)基內(nèi)一些化學成分的有效性，時間過短則達不到滅菌效果。過濾除菌法①消毒——培養(yǎng)基消毒①消毒——無菌操作室內(nèi)的滅菌方法①消毒——外植體的表面滅菌化學消毒劑滅菌法70%酒精、HgCl2、次氯酸鈉、過氧化氫、次氯酸鈣等外植體表面滅菌操作前的準備工作：①無菌水、漂洗瓶、切割用器皿和金屬器具均經(jīng)過高溫高壓滅菌并整齊擺放在超凈工作臺上。②滅菌劑配制好并整齊擺放在超凈工作臺上。外植體表面滅菌的一般過程外植體取材備用無菌水充分漂洗3～5次無菌條件下，消毒劑處理無菌條件下，70%酒精表面消毒30S～60S預處理影響外植體消毒效果的因素：①消毒劑種類②消毒劑使用濃度③消毒處理時間②接種——全部應在無菌條件下進行外植體接種操作前的準備工作②接種——全部應在無菌條件下進行外植體接種的具體步驟切割外植體培養(yǎng)瓶傾斜靠近酒精燈火焰瓶蓋外部在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒數(shù)秒鐘旋開瓶蓋，扣放在酒精燈旁邊瓶口在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒數(shù)秒鐘用無菌鑷子將外植體均勻放置在培養(yǎng)基上瓶蓋在火焰上灼燒兩圈蓋緊瓶蓋②接種——全部應在無菌條件下進行常用外植體的種類莖尖帶