結(jié)題文件修訂

具有激活皮膚成纖維干細(xì)胞功能的中藥單體計(jì)算機(jī)分子模擬篩選及功效研究中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院顧懷宇教授神經(jīng)抗衰老實(shí)驗(yàn)室2015-10-00

報(bào)告內(nèi)容虛擬篩選細(xì)胞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段總結(jié)未來(lái)規(guī)劃參考文獻(xiàn)第一章

計(jì)算機(jī)虛擬篩選定義虛擬篩選（virtualscreening,VS)

即在進(jìn)行生物活性篩選之前，在計(jì)算機(jī)上對(duì)化合物分子進(jìn)行預(yù)篩選，以降低實(shí)際篩選化合物數(shù)目，同時(shí)提高先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)效率。一、背景介紹篩選的對(duì)象化合物數(shù)據(jù)庫(kù)虛擬的實(shí)際存在的優(yōu)勢(shì)不消耗樣品，降低篩選成本考慮化合物分子的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)和毒性，增加篩選的內(nèi)涵虛擬篩選技術(shù)的分類根據(jù)靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)知識(shí)基于靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的虛擬篩選分子對(duì)接基于配體相似性的虛擬篩選藥效基團(tuán)搜尋基于靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的虛擬篩選——分子對(duì)接起源：受體-配體的鎖和鑰匙模型

配體受體復(fù)合物分子對(duì)接篩選常用的軟件DOCK是應(yīng)用比較廣泛的對(duì)接軟件之一，由Kuntz等設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)。它能自動(dòng)模擬配體在受體活性位點(diǎn)的作用情況，并記錄下最佳的相互作用方式。而且該軟件能對(duì)配體的三維數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，因此被廣泛用于基于受體結(jié)構(gòu)的對(duì)接篩選。AUTODOCK也是常用的分子對(duì)接軟件包之一，由Scripps的Olson科研小組開(kāi)發(fā)。它采用模擬退火和遺傳算法尋找受體和配體最佳的結(jié)合位置，用半經(jīng)驗(yàn)的結(jié)合自由能方法來(lái)評(píng)價(jià)兩者之間的匹配情況。為了加快計(jì)算速度，AUTODOCK采用了格點(diǎn)對(duì)接的方法，格點(diǎn)上保存的是探針原子和受體之間的相互作用能，包括了范德華相互作用能、靜電作用能和氫鍵相互作用能等。除此之外，還有一些常用的對(duì)接篩選程序，比如FlexX、GOLD、Affinity、Glide等，它們都各自開(kāi)發(fā)出一套相應(yīng)的對(duì)接篩選策略、打分函數(shù)，使得對(duì)接篩選的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。EGFREGFR是一種廣泛存在的糖蛋白EGFR能促進(jìn)表皮組織內(nèi)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂EGFR的激活可促進(jìn)細(xì)胞新生，抗衰老找到一種調(diào)控的藥物胞外域跨膜域胞內(nèi)域EGFR的變構(gòu)EGFR的工作機(jī)制13

14

EGFR可以啟動(dòng)兩條主要通路，這兩條通路最終都產(chǎn)生能夠直接作用于細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞周期從而控制細(xì)胞的增殖1、Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路：

ERK作用于其底物（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子），磷酸化下游的Elk-1,ATF,NF-κB,Ap-1,c-fos和c-Jun，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞周期，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。其下游的信號(hào)通路仍未被完全闡明。152、PI3K-PKB-Akt(PKB)通路：

PKB是原癌基因AKT的產(chǎn)物，此通路與細(xì)胞的增殖相關(guān)。具體通路也未被完全闡明。以上通路都可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與再生，因此，適當(dāng)激活EGFR時(shí)，便可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖。二、項(xiàng)目分子模擬技術(shù)詳情EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域與EGF結(jié)合的復(fù)合體161、明確模擬對(duì)象：

待計(jì)算配體以及EGFR蛋白結(jié)構(gòu)，所有EGFR蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)自于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，主要為解析度為2.8?的EGFR胞外域晶體結(jié)構(gòu)，以及解析度為3.3?的結(jié)合了EGF的變構(gòu)后的EGFR胞外域晶體結(jié)構(gòu)。17本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建EGFR分子模型：正視圖（左）和俯視圖（右）2、制定模擬方案：

首先，我們使用軟件SYBYL1.1修飾獲得的PDB文件，刪除冗余分子以及無(wú)關(guān)基團(tuán)，以獲得純凈的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。19

其次，我們使用軟件Autodock4.0設(shè)置空間坐標(biāo)，通過(guò)拉馬克遺傳算法（Lamarckiangeneticalgorithm），規(guī)定藥物分子的結(jié)合位點(diǎn)，一般而言，我們選定的活性位點(diǎn)即是配體（此處即為EGF）的結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)初始設(shè)置完畢。

正式模擬計(jì)算階段，我們使用Autodock中的AutoGrid模塊，計(jì)算配體和受體之間的結(jié)合自由能。此時(shí)為初步篩選，已經(jīng)可以獲得一部分分子與EGFR的親和信息。20再次，我們使用AMBER11模擬套件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)的模擬和數(shù)據(jù)分析。我們?cè)贓GFR的模擬中采用的力場(chǎng)是AMBERff03，這一力場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋和β-折疊的受力施力分配較為均衡，因此更適合于EGFR的模擬。我們采用的模擬環(huán)境是TIP3P水盒子，即水環(huán)境，由于人體中主要成分是水，因此我們認(rèn)為水環(huán)境下進(jìn)行的模擬更有說(shuō)服力。21

之后，我們進(jìn)行配體的調(diào)整。我們首先使用Gaussian03程序進(jìn)行配體分子的幾何結(jié)構(gòu)最優(yōu)化，從而獲得最穩(wěn)定的靜電勢(shì)能。并且使用AMBERGAFF程序規(guī)定配體的其余力場(chǎng)參數(shù)，最后使用AMBER11軟件的antechamber套件設(shè)定配體缺失的力場(chǎng)參數(shù)。至此分子模擬準(zhǔn)備完畢。23

最終，我們可以計(jì)算出EGFR和配體的結(jié)合自由能，從而可以對(duì)配體激活EGFR的能力作出一個(gè)計(jì)算機(jī)評(píng)價(jià)。

以上模擬計(jì)算使用了搭載了192AMDOpteron處理器組的超級(jí)計(jì)算機(jī)。24三、計(jì)算結(jié)果1、中草藥庫(kù)部分

通過(guò)分子模擬，我們暫時(shí)從34441種中草藥單體庫(kù)中篩選出了6個(gè)可以與EGFR結(jié)合形成良好構(gòu)象，并且在結(jié)合自由能評(píng)分中獲得較高分?jǐn)?shù)的中草藥單體。其主要來(lái)自于肉蓯蓉、三七、光甘草定。經(jīng)過(guò)比對(duì)2007年化妝品衛(wèi)生規(guī)范，以下中草藥單體均符合化妝品衛(wèi)生要求。兩次得分：-11.3；-11.2三七皂甙Rd人參皂苷Rg127C48H82O18計(jì)算機(jī)模擬結(jié)合自由能得分值名稱分子式C42H72O14兩次得分：-11.3；-10.8兩次得分：-8.5；-8.3人參皂苷Rb1C54H92O23兩次得分：-11.2；-10.9三七皂苷R1肉蓯蓉甙A28C47H80O18計(jì)算機(jī)模擬結(jié)合自由能得分值名稱分子式C36H48O20兩次得分：-11.5；-10.7兩次得分：-8.5、-8.3光甘草定C20H20O42、短肽庫(kù)部分

經(jīng)過(guò)對(duì)短肽庫(kù)的篩選，我們從4392種短肽中篩選出四種符合條件的短肽。它們分別為：

Arg-Arg-Tyr(RRY，精氨酸-精氨酸-酪氨酸)；

Arg-Phe-Trp（RFW，精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸）；

Trp-Arg-Tyr（WRY，色氨酸-精氨酸-酪氨酸）；

Arg-Trp-Tyr（RWY，精氨酸-色氨酸-酪氨酸）。29兩次得分：-9.5；-9.7精氨酸-精氨酸-酪氨酸30計(jì)算機(jī)模擬結(jié)合自由能得分值名稱分子式兩次得分：-9.6；-9.5精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸兩次得分：-9.4；-9.5精氨酸-色氨酸-酪氨酸31計(jì)算機(jī)模擬結(jié)合自由能得分值名稱分子式兩次得分：-9.3；-9.6色氨酸-精氨酸-酪氨酸32部分EGFR-配體作用3D模型計(jì)算機(jī)模擬Arg-Arg-Tyr--EGFR作用。結(jié)果顯示：兩次模擬得分分別為-9.5、-9.7；結(jié)合自由能：?31.2kJ/mol計(jì)算機(jī)模擬Arg-Trp-Tyr--EGFR作用。結(jié)果顯示：兩次模擬得分分別為-9.3、-9.6；結(jié)合自由能：?32.6kJ/mol36計(jì)算機(jī)模擬光甘草定-EGFR作用。結(jié)果顯示：兩次模擬得分分別為-8.5、-8.3；結(jié)合自由能：-33.7146kJ/mol第二章

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)392.1、CCK-8法細(xì)胞篩選CellCountingKit-8簡(jiǎn)稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜染料(參考圖1)。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。40短肽RRY實(shí)驗(yàn)結(jié)果用不同濃度RRY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細(xì)胞，cck-8檢測(cè)HSF細(xì)胞的增殖，干預(yù)第一天，各組細(xì)胞增殖效應(yīng)無(wú)顯著差異；干預(yù)第三天，與對(duì)照組比較，RRY0.1、1、10μM處理組細(xì)胞增殖均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。41短肽RWY實(shí)驗(yàn)結(jié)果用不同濃度RWY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細(xì)胞，cck-8檢測(cè)HSF細(xì)胞的增殖，干預(yù)第一天，各組細(xì)胞增殖效應(yīng)無(wú)顯著差異；干預(yù)第三天，與對(duì)照組比較，RWY0.1、1、10μM處理組細(xì)胞增殖均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。42短肽RFW實(shí)驗(yàn)結(jié)果用不同濃度RFW(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細(xì)胞，CCK-8法結(jié)果顯示：干預(yù)第一天，0.001、0.1、1、10、100、500μM濃度RFW組細(xì)胞增殖均高于對(duì)照組，0.01μM組均低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)第三天，0.001、0.01、0.1、1、10、100μM組吸光度值高于對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），而500μM組吸光度值低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。同時(shí)，各干預(yù)組干預(yù)1，3天，各孔的吸光度值隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。43短肽WRY實(shí)驗(yàn)結(jié)果用不同濃度WRY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細(xì)胞，CCK-8法結(jié)果顯示：干預(yù)第一天，0.001、0.01、0.1、10、100μM濃度WRY組細(xì)胞增殖均高于對(duì)照組，1、500μM組均低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)第三天，0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM組吸光度值低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。44中草藥單體光甘草定實(shí)驗(yàn)結(jié)果用不同濃度光甘草定(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細(xì)胞，CCK-8法結(jié)果顯示：干預(yù)第一天，0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM濃度與對(duì)照組相比無(wú)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)第三天，0.1、1、10μM組細(xì)胞增殖均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。綜上，短肽RRY、RWY和光甘草定都能引起HSF增殖。我們?cè)诤罄m(xù)EdU實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)驗(yàn)證以上三種分子對(duì)細(xì)胞的增殖效果。462.2、EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖

EdU（5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷）是種胸腺嘧啶核一種胸腺嘧啶核苷類似物。它也能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過(guò)基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)檢測(cè)DNA復(fù)制活性，通過(guò)檢測(cè)EdU標(biāo)記便能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況。EdU檢測(cè)染料只有通?？贵w大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無(wú)需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測(cè)，可有效避免樣品損傷，在細(xì)胞和組織水平能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖等現(xiàn)象。EdU檢測(cè)原理示意圖采用EdU法分別定量檢測(cè)藥物干預(yù)條件下誘導(dǎo)3d后皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力，如圖所示。結(jié)果顯示：短肽Arg-Arg-Tyr對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以1μM作用最為明顯。采用EdU法分別定量檢測(cè)藥物干預(yù)條件下誘導(dǎo)3d后皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力，如圖所示。結(jié)果顯示：短肽Arg-Trp-Tyr對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以1μM作用最為明顯。采用EdU法分別定量檢測(cè)藥物干預(yù)條件下誘導(dǎo)3d后皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力，如圖所示。結(jié)果顯示：中草藥單體光甘草定對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以10μM作用最為明顯。512.3、流式細(xì)胞測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個(gè)原理，可測(cè)出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測(cè)。Pi分子結(jié)構(gòu)Pi與DNA分子結(jié)合DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期G2MG0G1s

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4N

G1期為DNA合成前期，是細(xì)胞為S期的DNA的合成做準(zhǔn)備的階段；S期即DNA合成期，一般處于增殖旺盛階段的細(xì)胞在此期細(xì)胞比例較高，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；G2期為細(xì)胞分裂前期；M期為細(xì)胞有絲分裂期。采用流式細(xì)胞法分別定量檢測(cè)藥物干預(yù)條件下誘導(dǎo)3d后皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力，如圖所示。結(jié)果顯示：短肽Arg-Arg-Tyr對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以1μM作用最為明顯。采用流式細(xì)胞法分別定量檢測(cè)藥物干預(yù)條件下誘導(dǎo)3d后皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力，如圖所示。結(jié)果顯示：短肽Arg-Trp-Tyr對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以1μM作用最為明顯。采用流式細(xì)胞法分別定量檢測(cè)藥物干預(yù)條件下誘導(dǎo)3d后皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力，如圖所示。結(jié)果顯示：中草藥單體光甘草定對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以10μM作用最為明顯。結(jié)論：本章實(shí)驗(yàn)通過(guò)cck-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)篩選具有生物活性短肽RRY、RWY和光甘草定；EdU增殖結(jié)果與cck-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)基本吻合；流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示短肽RRY、RWY和光甘草定通過(guò)激活S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。第三章

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法皮膚表面肉眼觀察組織形態(tài)學(xué)觀察標(biāo)本采集石蠟包埋切片制作皮膚組織HE染色皮膚組織PCNA免疫組織化學(xué)染色鏡檢觀察各組小鼠背部皮膚一般形態(tài)觀察各組小鼠背部皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察各組小鼠背部皮膚組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果圖13短肽RRY組PCNA免疫組化染色圖14短肽RWY組PCNA免疫組化染色圖15光甘草定組PCNA免疫組化染色結(jié)論：本章實(shí)驗(yàn)通過(guò)綜合運(yùn)用肉眼觀察、HE染色方法、免疫組織化學(xué)染色方法，從組織形態(tài)生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)，較全面的驗(yàn)證了短肽RRY、RWY和光甘草定對(duì)SD鼠皮膚的影響。結(jié)果顯示短肽RRY、RWY和光甘草定對(duì)正常SD鼠皮膚組織無(wú)毒副作用，對(duì)于皮膚安全可靠。且能增強(qiáng)皮膚組織PCNA的表達(dá)，具有一定的修復(fù)作用。66第四章階段總結(jié)

產(chǎn)生知識(shí)產(chǎn)權(quán)項(xiàng)本項(xiàng)目截止此階段，預(yù)計(jì)可申報(bào)國(guó)家專利申請(qǐng)3項(xiàng)；本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，預(yù)計(jì)可撰寫(xiě)科研論文3篇；建議目前即可開(kāi)始知識(shí)產(chǎn)權(quán)申請(qǐng)事宜。67第五章未來(lái)規(guī)劃

中草藥的粗提物是包含功能性單體的初級(jí)純化產(chǎn)物，因其生產(chǎn)成本較低等特性，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。同時(shí)，工業(yè)化生產(chǎn)的中草藥粗提物其理化性質(zhì)較穩(wěn)定，可為功能性單體物質(zhì)提供穩(wěn)態(tài)的微環(huán)境。因此，功能性分子單體復(fù)配中草藥粗提物是未來(lái)產(chǎn)業(yè)化研發(fā)的發(fā)展趨勢(shì)，是基于生物化學(xué)分子調(diào)控研究的基礎(chǔ)上，有較高可行性的實(shí)踐方案。短肽的合成、同位素標(biāo)記、體內(nèi)代謝追蹤。68參考文獻(xiàn)[1]Echinacosideimproveshematopoieticfunctionin5-FU-inducedmyelosuppressionmice,SaisaiWang,GangZheng,ShoushengTian,LijuanShen,YongcholPak,YongShen,JingQian,LifeSciences123(2015)86–92.[2]NF-kBplaysakeyroleinmicrocystin-RR-inducedHeLacellproliferationandapoptosisLiangChen,XinZhang,JunChen,XuezhenZhang,HuihuiFan,c,ShangchunLi,PingXie,Toxicon87(2014)120-130.[3]Down-regulationofFRαInhibitsProliferationandPromotesApoptosisofCervicalCancerCellsinVitro,Li-XiaBai,LingDing,Shi-WenJiang,Hui-JieKang,Chen-FeiGao,ChenChe