緩沖溶液的配制

緩沖溶液緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比即可制得不同pH的緩沖液。緩沖溶液的正確配制和pH值的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極為重要的意義，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH值下進(jìn)行的，而且受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控，能夠做到這一點(diǎn)是因?yàn)樯矬w內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)和活動(dòng)需要一定的pH值，體內(nèi)pH環(huán)境的任何改變都將引起與代謝有關(guān)的酸堿電離平衡移動(dòng)，從而影響生物體內(nèi)細(xì)胞的活性。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有體內(nèi)過程完全相同的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學(xué)的各種研究工作中和生物技術(shù)的各種開發(fā)工作中，深刻地了解各種緩沖試劑的性質(zhì)，準(zhǔn)確恰當(dāng)?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，精確地測(cè)定溶液的pH值，就是非常重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工作。下表列出某些人體體液的pH值：1一3人體體液pH體液 PH 體液 PHiflL清 7.35 ? 大腸液 &3?8.47.45成人胃液 0.9?1.5 淚 6.6?6.9唾液 6.3?7.1 尿 4.8?7.5胰液 7.5?8.0 腦脊液 7.35 ?7.457.1基本概念（1）Bronsted-Lowry酸堿理論（又稱酸堿質(zhì)子理論）。1923年由丹麥化學(xué)家J.N.Bronsted和英國(guó)化學(xué)家T.M.Lowry同時(shí)提出了酸堿質(zhì)子學(xué)說，發(fā)展了酸堿理論，被后人稱為酸堿質(zhì)子理論或Bronsted-Lowry酸堿理1/13論。他們認(rèn)為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如:H2O,HC1,NHf,HSOr等）稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O,NH3,C廠等）稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該酸的共轆堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對(duì)應(yīng)的酸，稱為該堿的共覘酸。A—H+B-——xA+B—HX酸1堿2堿1酸21是堿1的共覘酸，堿2是酸2的共覘堿。如鹽酸在水中的解離：HC1:~~~ +H+HC1是酸，C廠是它的共覘堿。（2）緩沖體系的設(shè)計(jì)：強(qiáng)電解質(zhì)溶于水幾乎全部解離為正負(fù)離子，弱電解質(zhì)溶于水時(shí)，則不完全解離，只有部分的分子解離出正負(fù)離子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其鹽溶于水時(shí)，只有部分HA解離為H+和A—離子，其平衡方程式如下：K,HA、一、PC+H+ （1-1）K2K°"[HA](1-2)—lg[H亠]=—lgK+lg電1(1-2)式兩邊取負(fù)對(duì)數(shù)：^A](I_3)（1-3）式中：[HA]—為弱酸的濃度[H+]—為HA解離出的氫離子濃度[A—]—為HA的共覘堿的離子濃度Kt—為酸解離的速度常數(shù)K2—為A一與H+締合的速度常數(shù)2/13Ka—為反應(yīng)方程(1-1)達(dá)平衡時(shí)HA的解離平衡常數(shù)現(xiàn)將HA的pKa定義為一lgKa,將HA溶液的pH定義為一log［H+］,(1-3)式可寫為：(1-4)pH=pK+lg［離解形式］或:a［未離解形(1-5)方程(1-4)稱為:Henderson-Hassel-Balch方程，此方程對(duì)于生物化學(xué)學(xué)科，在理論與實(shí)踐上都具有重要意義。該方程表示了溶液pH與溶質(zhì)中可解離基團(tuán)p?之間的關(guān)系。很明顯，當(dāng)［A—］=［HA］時(shí)：pH=pKa這就意味著當(dāng)［HA］有一半解離時(shí)，溶液的pH等于pKa，此弱酸一堿緩沖體系的pKa即代表緩沖范圍的中點(diǎn)。一個(gè)緩沖體系的有效緩沖范圍，通常是在pKd值為中點(diǎn)的兩個(gè)pH單位范圍內(nèi)，即：緩沖劑的有效pH范圍=pKa±l,所以，當(dāng)緩沖溶液的pH等于該緩沖劑的P&時(shí)，緩沖能力最大。若要設(shè)計(jì)一個(gè)新的緩沖體系時(shí)，只需按所要求的pH值查出pK“值等于此pH值的各種緩沖劑并從中進(jìn)行挑選即可。1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性：①pK/直在6?8之間；②在水中的溶解度高；③不易穿透生物膜；④鹽效應(yīng)小；⑤離子濃度、溶液組成和溫度對(duì)解離的影響??；⑥不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀；⑦該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定；⑧紫外和可見光波長(zhǎng)范圍內(nèi)光吸收?。虎嵋字频酶呒兌鹊柠}。按照這些要求可以設(shè)計(jì)和選擇最為合適的緩沖劑來配制所需的緩沖溶液。7.2生物化學(xué)常用緩沖液(1)磷酸鹽緩沖液磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級(jí)解離，有二個(gè)P?值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬:NaH2PO4： pKai=2.12, pKa2=7.21Na2HPO4： pKai=7.21, pKa2=12.32配酸性緩沖液配中性緩沖液配堿性緩沖液

NaHgPCU，pH=l?4,用混合的兩種磷酸鹽，pH=6?8,用NagHPCU，pH=10?12。3/13用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS(十二烷基硫酸鈉)會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的pH范圍寬；③pH受溫度的影響??；④緩沖液稀釋后pH變化小,如稀釋十倍后pH的變化小于O.lo其缺點(diǎn)為：①易與常見的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會(huì)抑制某些生物化學(xué)過程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑XXX用。(2)Tris(三疑甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane)緩沖液Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢(shì)，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中己都使用Tris緩沖液,而很少再用磷酸鹽。Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如：Tris-HCl緩沖液： pH=7.5?8.5Tris-磷酸鹽緩沖液：pH=5.0?9.0配制常用的緩沖液的方法有兩種：①按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制0,05mol/LTris和0.05moI/LHC1溶液，然后按表中所列體積混合。由于標(biāo)準(zhǔn)濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；②若IL0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱12.11gTris堿溶于950mL?970mL無離子水中，邊攪拌邊滴加4NHC1,用pH計(jì)測(cè)定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補(bǔ)足到lLoTris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是：①因?yàn)門ris堿的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；②對(duì)生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其缺點(diǎn)是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；②溫度效應(yīng)大，溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響很大,即：ApKa/°C=-0.031,例如：4°C時(shí)緩沖液的pH=8.4,則37°C時(shí)的pH=7.4,所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0°C?4°C。③易吸收空氣中的82,所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。④此緩沖液對(duì)某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用,所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。（3） 有機(jī)酸緩沖液4/13這一類緩沖液多數(shù)是用竣酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH=3.0?6.0,最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。甲酸?甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強(qiáng)，使用后可以用減壓法除之。乙酸~乙酸鈉和檸檬酸~檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個(gè)p?值：pKai=3.10,pKa2=4.75,pKa3=6.40o琥珀酸有二個(gè)P&值：pKaI=4.18,pKa2=5.60o有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：①所有這些竣酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對(duì)生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe%、Zn+\Mg”等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；③這類緩沖液易與Ca++離子結(jié)合，所以樣品中有Ca++離子時(shí)，不能用這類緩沖液。（4） 硼酸鹽緩沖液常用的有效pH范圍是：pH=8.5?10.0,因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的疑基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。（5） 氨基酸緩沖液此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0?11.0,例如最常用的有:甘氨酸一HC1緩沖液：pH=2.0?5.0,甘氨酸一NaOH緩沖液：pH=8.0?11.0,甘氨酸一Tris緩沖液：pH=8.0?11.0,（此緩沖液用于廣泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）,組氨酸緩沖液：pH=5.5?6.5,甘氨酰胺（glycineamide）緩沖液：pH=7.8?&8,甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）緩沖液：pH=8.0?9.0。此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點(diǎn)是：①與竣酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。②試劑的價(jià)格較高。兩性離子緩沖液(Zwitterionicbuffers),又稱Good's緩沖液1960年，N.E.Good和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu)缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計(jì)和人工合成的方法來找到專門用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有前而所述的九條要求和特性。他們合成的一系列Goodl緩沖液可查閱有關(guān)的資料。Good's緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)是不參加和不干擾生物化學(xué)反應(yīng)過程，對(duì)酶化學(xué)反應(yīng)等無抑XXX用，所以它們專門用于細(xì)胞器和極易變性的、對(duì)pH敏感的蛋口質(zhì)和酶的研究工作。其缺點(diǎn)是：①價(jià)格昂貴，②對(duì)測(cè)定蛋5/13口質(zhì)含量的雙縮腺法和Lowry法不適用，因?yàn)樗鼈儠?huì)使空白管的顏色加深。常用緩沖溶液的配制方法1.甘氨酸-鹽酸緩沖液(0?05mol/L)X亳升0.2mol/L甘氨酸+Y亳升0.2mol/LHCL再加水稀釋至200亳升PHXYPHXY2.05()44.03.05011.42.45032.43.2508.22.65024.23.4506.42.85016.83.6505.0甘氨酸分子量=75.07,0.2moVL甘氨酸溶液含15.01克/升。2.鄰苯二甲酸■鹽酸緩沖液(0.05mol/L)X亳升0.2n】ol/L鄰苯二甲酸氫鉀+0.2mol/LHC1,再加水稀釋到20亳升pH(20°C)XYpH(20C)XY2.254.0703.251.4702.453.9603.450.9902.653.2953.650.5972.852.6423.850.2633.052.022鄰苯二甲酸氫鉀分子量=204.23,0.2mol/L鄰苯二甲酸氫溶液含40.85克/升3.磷酸氫二鈉■檸檬酸緩沖液PH0.2mol/L0.1mol/LPH0.2mol/L0」mol/LNa2HPO4檸椽酸(亳升)Na2HPO4檸椽酸(亳升)(亳升)(亳升)2.20.4010.605.210.729.282.41.2418.765.411.158.852.62.1817.825.611.608.402.83」716.835.S12.097.916/133.04.1115.896.012.637373.24.9415.066.213.226.783.45.7014.306.413.856」53.66.4413.566.614.555.453.87.1012.906.815.454.554.07.7112.297.016.473.534.28.2811.727.217.392.614.48.8211.187.418.171.834.693510.657.618.731.274.89.8610.147.819.150.855.010309.7()S.019.450.55Na田POA分子量=14.98,0.2mol/L溶液為28.40克/升。Na2HPO4?2H2O分子量=178.05,0.2mol/L溶液含 35.01克/升。C4H2O7?H2O分子量=210.14,0.1mol/L溶液為21.01克/升。4.檸檬酸■氫氧化鈉-鹽酸緩沖液PH鈉離子濃度檸掾酸（克）氫氧化鈉（克）鹽酸（亳升）最終體積（mol/L）CHSO7?H2ONaOH97%HC1（濃）（升）①62.20.202108416()103」0.2021083116103.30.2021083106104.30.202108345105.303524514468105.80.45285186105106.50.3S26615612610①使用時(shí)可以每升中加入1克克酚，若最后pH值有變化，再用少量50%氫氧化鈉溶液或濃鹽酸調(diào)節(jié)，冰箱保存。5.檸檬酸-檸據(jù)酸鈉緩沖液（0.1mol/L）PH0.1mol/L0」mol/L檸樣酸（亳檸掾酸鈉升）（亳升）3.01&61.43.217.22.83.416.04.03.614.95」3.814.06.04.013.16.94.21237.74.411.4&64.610.39.74.89.2KI.S

PH0」mol/L檸檬0」mol/L酸檸檬酸鈉（亳升）（亳升）5.()8.211.85.27.312.75.46.413.65.65.514.55.84.71536.03.816.26.22.817.26.42.018.06.61.418.6檸檬酸C6HO7?HO：分子量210.14,0.1mol/L溶液為21.01克/升。H 2檸檬酸鈉Na3C6H5O7?2H2O：分子量294.12,0.1mol/L溶液為29.41克/亳升。7/136.乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.2moVL）0.2mol/L03mol/L0.2mol/LpH（18°C）NaAcHAcpH（18C）NaAc0.3mol/L（亳升）（呈升）（亳升）HAc（亳升）2.60.759.254.85.904」03.81.208.805.07.003.004.01.80&205.27.902」04.22.657355.48.601.404.43.706.305.69.100.904.64.9（）5.105.X9.400.60Na2Ac-3H2O分子量=136.09,0.2mol/L溶液為 27.22克/升。7.磷酸鹽緩沖液（1）磷酸氫二鈉■磷酸二氫鈉緩沖液（0.2）0.2mol/L0.3mol/L0.2mol/L0.3mol/LPHNa2HPO4（亳NaH2PO4（毫PHNaHPONaH2PO424升）升）（亳升）（毫升）5.88.092.07.061.039.05.910.090.07」67.033.06.012387.77.272.02&06」15.085.07377.023.06.21&581.57.481.019.06.322.577.57.584.016.06.426.573.57.687.013.06.531.56&57.789.510.56.637.562.57.891.58.56.743.556.57.993.07.06.849.551.0&094.7536.955.045.0Na2HPO4-2H2O分子量=178.05,0.2mol/L溶液為 85.61克/升。Na2HPO412H2O分子量=358.22,0.2mol/L溶液為 71.64克/升。NaH2PO4-2H2O分子量二 156.03,0.2mol/L溶液為 31.21克/升。（2）磷酸氫二鈉?磷酸二氫鉀緩沖液（1/15mol/L）PHmol/L/15NaHPO4mol/L//15KHPO4PHmol/L//15NaHPO4mol/L//15KHPO42222（亳升）（毫升）（毫升）（亳升）4.920.109.907.177.003.005.290.509.507388.002.005.911.009.007.739.001.006.242.008.00&049.500.506.473.007.008349.750.258/136.644.006.008.679.900.106.815.005.008.1810.0006.986.004.0()Na2HPO4-2H2O分子量=178.05,I/15M溶液為 11.876克/升。KH2PO4分子量=136.09,1/I5M溶液為 9.078克/升。8.磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液（0.05M）X亳升0.2MQPO#Y亳升0.2NNaOH加水稀釋至29亳升pH(20°C)X（亳升）Y（亳升）pH(20C)X（亳升）Y（亳升）5.850.3727.052.9636.050.5707.253.5006.250.8607.453.9506.451.2607.654.2806.651.7807.854.5206.852.365S.054.6809.巴比妥鈉-鹽酸緩沖液（189）PH0.04M巴比妥0.2V鹽酸PH0.04M巴比妥0.2N鹽酸（亳鈉溶液鈉溶液（亳升）升）6.810018.48.41005.217.010017.88.61003.827.210016.78.81002.527.41001539.01001.657.610013.49.21001」37.810011.479.41000.70&01009399.61000.35&21()()7.21100巴比妥鈉鹽分子M=206.18;0.04M溶液為&25克/升10.Tris-鹽酸緩沖液（0.05M,25*050毫升0.1M三疑甲基氨基甲烷（Tris）溶液與X亳升0.1N鹽酸混勻后，加水稀釋至100亳升。PHX（亳刑PHX（毫升）7.1045.7&1026.27.2044.78.2022.97.3043.483019.97.4042.0&4017.27.5040.38.5014.77.6038.58.6012.47.7036.68.701037.8034.58.80&57.9032.08.907.08.0029.29/13三疑甲基氨基甲烷（Tris）HOCH2CH20HCHOCH2NH2分子量=12