第八章反膠團萃取

第八章反膠團萃取概述反膠團的形成反膠團的理化特性及制備反膠團萃取的原理在分離工藝中的應(yīng)用概述1.概念反膠團(ReversedMicelles)是兩性表面活性劑在非極性有機溶劑中親水性基團自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的，內(nèi)含微小水滴，空間尺度僅為納米級的集合型膠體。反膠團的兩個特異性功能（1）具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能：（2）在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性的功能。反膠團萃取在分離蛋白中應(yīng)用的優(yōu)點（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性;(2)分離和濃縮可同時進行，過程簡便;（3）能解決蛋白質(zhì)在非細胞環(huán)境中迅速失活的問題；（4）由于構(gòu)成反膠團的表面活性劑具有細胞破壁功能，所以可直接從完整細胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；（5）反膠團萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。反膠團的構(gòu)造當向非極性溶劑中加入表面活性劑時，如表面活性劑的濃度超過一定的數(shù)值時，在非極性溶劑中表面活性劑聚集成團，其疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)，與在水相中行成的微膠團方向相反，因而稱為反膠團。反膠團體系的分類

1、單一表面活性劑反膠團體系

研究得最多的是陰離子型ＡＯＴ,該體系結(jié)構(gòu)簡單和穩(wěn)定,反膠團體積相對較大,適用于等電點較高的較小相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離,其次有ＤＯＬＰＡ(二油基磷酸)。另一類是陽離子表面活性劑,如ＣＴＡＢ(溴代十六烷基三甲銨),ＴＯＭＡＣ（氯化三辛基甲銨）,ＤＡＰ(十二烷基丙酸銨),ＤＤＡＢ(二十二烷基二甲基溴化銨)等。該體系適用于等電點較低的較大相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離。而非離子型表面活性劑能構(gòu)成更大的反膠團,但這類體系容易乳化。一般在使用時無須加入助劑的表面活性劑具有多條中等長度的烷基尾和一個較小的極性頭,如ＡＯＴ,ＤＤＡＢ有二條疏水尾,而ＴＯＭＡＣ有三條疏水尾。

2、混合表面活性劑反膠團體系

這是指兩種或兩種以上表面活性劑構(gòu)成的體系,一般來說,混合表面活性劑反膠團體系對蛋白質(zhì)有更高的分離效率。例如將ＡＯＴ與ＤＥＨＰＡ(二-(2-乙基己基)磷酸)構(gòu)成的混合體系,可萃取相對分子質(zhì)量較大的牛血紅蛋白,萃取率達80%。其他,如ＡＯＴ/ＤＯＬＰＡ,ＡＯＴ/Ｔｗｅｅｎ85體系對蛋白質(zhì)的萃取能力都優(yōu)于單一的ＡＯＴ體系。非離子表面活性劑的加入可使反膠團變大,從而可萃取相對分子質(zhì)量更大的蛋白質(zhì)。

3、親和反膠團體系

這是指體系中除了有組成膠團的表面活性劑外,還有具有親和特性的助劑,它的親和配基與目標蛋白質(zhì)有特異的結(jié)合能力,往往極少量親和配基的加入就會使萃取蛋白質(zhì)的選擇性大大提高。例如,以一種三嗪藍染料ＣＢ(ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ3ＧＡ)為親和配基,極少量的加入ＣＴＡＢ體系后,可以萃取原來不被萃取的牛血清白蛋白。

影響反膠團萃取生物分子的主要因素

1水相ｐＨ值的影響

表面活性劑的極性頭朝向反膠團內(nèi)部,使反膠團的內(nèi)壁帶有一定的電荷。而蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì),水相的ｐＨ值決定了蛋白質(zhì)分子表面可電離基團的離子化程度,當?shù)鞍踪|(zhì)所帶的電荷與反膠團內(nèi)所帶的電荷性質(zhì)相反時,由于靜電引力,可使蛋白質(zhì)于反膠團中。例如:當用陰離子表面活性劑ＡＯＴ構(gòu)成反膠團時,其內(nèi)壁帶負電荷,若水相的ｐＨ值<蛋白質(zhì)的等電點ｐＩ,則蛋白質(zhì)帶正電荷,在靜電引力的作用下,使蛋白質(zhì)進入反膠團而實現(xiàn)了萃取。相反,當ｐＨ>ｐＩ時,由于靜電斥力,使溶入反膠團的蛋白質(zhì)反向萃取出來,實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃。若使用的是陽離子表面活性劑,則情況與上相反。因此,水相的ｐＨ值是影響反膠團萃取蛋白質(zhì)的最主要因素。

影響反膠團萃取生物分子的主要因素

2水相離子強度的影響

水相離子強度的增加產(chǎn)生兩方面的影響:

(1)離子強度影響到反膠團內(nèi)壁靜電屏蔽的程度,降低了蛋白質(zhì)分子與反膠團內(nèi)壁的靜電作用力；

(2)減小了表面活性劑極性頭之間的相互斥力,使反膠團變小。這兩方面的效應(yīng)都會使蛋白質(zhì)的溶解性下降,甚至使已溶解的蛋白質(zhì)從反膠團中反萃出來。

影響反膠團萃取生物分子的主要因素3助表面活性劑的影響

蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量往往很大,超過幾萬至幾十萬,使表面活性劑形成的反膠團的大小不足以包容大的蛋白質(zhì),而無法實現(xiàn)萃取。此時,加入一些非離子表面活性劑,使它們插入反膠團的結(jié)構(gòu)中,就可以增大反膠團的尺寸,溶解較大相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。

影響反膠團萃取生物分子的主要因素4溶劑體系的影響

溶劑的性質(zhì),尤其是極性,對反膠團的形成和大小都有影響,常用的溶劑有:烷烴類(正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷、正十二烷等)、四氯化碳、氯仿等等。有時也用添加助溶劑,如醇類(正丁醇等)來調(diào)節(jié)溶劑體系的極性,改變反膠團的大小,增加蛋白質(zhì)的溶解度。反膠團的物理化學(xué)特性及制備（1）反膠團的臨界膠團濃度：將表面活性劑在非極性有機溶劑相中能形成反膠團的最小濃度稱為臨界膠團濃度。（大多數(shù)在0.1～1.0mmol/L的范圍內(nèi)。（2）反膠團含水率W：用水和表面活性劑的濃度之比來定義。W越大，反膠團的半徑越大。當W＜６～８時，微水相中的水分子被表面活性劑親水性基團強烈的束縛，其表觀粘度可增大到普通水粘度的50倍，且冰點通常低于0攝氏度。反膠團的制備方法1：注入法——將含有蛋白質(zhì)的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性溶劑中去，然后進行攪拌直到形成透明的溶液為止。這種方法的過程較快并可較好的控制反膠團的平均直徑和含水量。方法2：相轉(zhuǎn)移法——將酶或蛋白質(zhì)從主體水相轉(zhuǎn)移到含表面活性劑的非極性有機溶劑中形成反膠團—蛋白質(zhì)溶液。即將含蛋白質(zhì)的水相與含表面活性劑的有機相接觸，在緩慢的攪拌下，一部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入（萃入）有機相。此過程較慢，但最終的體系處于穩(wěn)定的熱力學(xué)平衡狀態(tài)，這種方法可在有機溶劑相中獲得較高的蛋白質(zhì)濃度。方法3：溶解法——對非水溶型蛋白質(zhì)可用該法。將含有反膠團的有機溶劑與蛋白質(zhì)固體粉末一起攪拌，使蛋白質(zhì)進入反膠團中，該法所需時間較長。含蛋白質(zhì)的反膠團也是穩(wěn)定的，這也說明反膠團“水池”中的水與普通水的性質(zhì)是有區(qū)別的。反膠團萃取原理從宏觀上看反膠團萃取，是有機相和水相劑間的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微觀上，是從主體水相向溶解于有機溶劑相中納米級的、均一且穩(wěn)定的,分散的反膠團微水相中的分配萃取。從原理上，可當作“液膜”分離操作的一種。萃取進入有機相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，從而避免了與有機溶劑相直接接觸而引起的變性，失活。蛋白質(zhì)的溶解蛋白質(zhì)向非極性溶劑中反膠團的納米級水池中的溶解，有四種可能：(1)為水殼模型

(2)蛋白質(zhì)中的親脂部分直接與非極性溶劑的碳氫化合物相接觸

(3)蛋白質(zhì)被吸附在微膠團的“內(nèi)壁”上

(4)蛋白質(zhì)被幾個微膠團所溶解，微膠團的非極性尾端與蛋白質(zhì)的親脂部分直接作用反膠團萃取決定生理活性物質(zhì)從主體水相萃入反膠團微水相內(nèi)的分配系數(shù)，萃取率取決于分離場，分離目標物質(zhì)間的相互作用：（1）靜電相互作用（2）立體性相互作用（3）疏水性相互作用（4）特異性相互作用酶，蛋白質(zhì)萃取特性酶，蛋白質(zhì)等生物大分子的空間尺度與反膠團的大小相接近。因而所有的相互作用關(guān)系都很重要。（1）靜電相互作用：(a)對于小分子蛋白質(zhì)(Mr<20000),pH>pI時，蛋白質(zhì)不能溶入膠團內(nèi)，但在等電點附近，急速變?yōu)榭扇?。當pH<pI時，即在蛋白質(zhì)帶正電荷的pH范圍內(nèi)，它們幾乎完全溶入膠團內(nèi)。

(b)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量增大到一定程度，即使將pH向酸性一側(cè)偏離pI，萃取率也會降低。（c）相對分子量更大的BSA，全pH范圍內(nèi)幾乎都不能萃?。挫o電相互作用效果無限小，可忽略不計）（d）降低pH，正電荷量增加，似乎有利于萃取率的提高。這被認為是蛋白質(zhì)的pH變性所造成的。（e）添加KCL等無機鹽，靜電性相互作用變?nèi)?，萃取率下降。立體性相互作用增大。(2)立體性相互作用：隨著蛋白質(zhì)分子量的增大，蛋白質(zhì)分子和膠團間的立體性相互作用增加，萃取率有下降趨勢。（3）其他的相互作用：主要是疏水性相互作用和特異性相互作用，目前研究不多。

正向膠團(ｎｏｒｍａｌｍｉｃｅｌｌｅ)是表面活性劑分子在極性溶劑,如水中形成的一種親水基團(頭)朝外,而疏水基團(尾)朝內(nèi)的具有非極性內(nèi)核的多分子聚集體。洗滌劑中的表面活性劑分子在水中形成的就是這種膠團,其非極性內(nèi)核可以溶解各種油污。從而達到去污的效果。與此相反,表面活性劑在非極性溶劑如某些有機溶劑中就會形成親水頭向內(nèi)和疏水尾向外的具有極性內(nèi)核(ｐｏｌａｒｃｏｒｅ)的多分子聚集體(ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ),由于其表面活性劑的排列方向與一般的正向膠團相反,因此,稱為反膠團。

在分離工藝中的應(yīng)用反膠團的極性內(nèi)核可以溶解某些極性物質(zhì),而且在此基礎(chǔ)上還可以溶解一些原來不能溶解的物質(zhì),即所謂二次加溶原理。例如,反膠團的極性內(nèi)核在溶解了水后,在內(nèi)核形成了“水池”

(ｗａｔｅｒｐｏｏｌ),可以進一步溶解蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等生物活性物質(zhì)。由于膠團的屏蔽作用,使這些生物物質(zhì)不與有機溶劑直接接觸,而水池的微環(huán)境又保護了生物物質(zhì)的活性,達到了溶解和分離生物物質(zhì)的目的。

這種技術(shù)既利用了溶劑萃取的優(yōu)點,又實現(xiàn)了生物物質(zhì)的有效分離,成為一種新型的生物分離技術(shù)。

應(yīng)用：三種蛋白質(zhì)的相互分離

利用反膠團的方法萃取分離蛋白質(zhì)的研究中,采用ＡＯＴ/異辛烷反膠團體系,通過調(diào)節(jié)水相的ｐＨ和離子強度,分別將α-核糖核酸酶、細胞色素Ｃ和溶菌酶從三者的混合液中分離開來。表8-2為這三種蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量。

它們的相對分子質(zhì)量相近,但等電點有一定的差別。在分離工藝中的應(yīng)用當ｐＨ>某個蛋白質(zhì)的ｐＩ時,蛋白質(zhì)帶？帶負電荷,相反時蛋白質(zhì)帶正電荷。