大三上課程內容-診斷學甲2013實驗

實驗診斷學實驗2浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院楊大干內容1.白細胞分類計數*2.尿蛋白定性試驗（加熱醋酸法）*3.尿糖定性試驗（班氏糖還原試驗）*4.尿液鏡檢*5.腦脊液蛋白質定性試驗（潘氏試驗）示教6.漿膜粘蛋白定性試驗（Rivalta試驗）示教7.瑞氏染色方法1.取1滴血于潔凈的玻片上推制成長約3~4cm的薄血片，要求頭、體、尾清晰可見。

2.室溫中自然干燥.3.瑞氏染色：加染液A3-5滴于血膜上，待覆蓋全部血膜后30秒，加染液B3-5滴，30秒后用水沖洗干凈待干。

4.選擇體尾交界的區(qū)域，用油鏡計數100個白細胞，根據形態(tài)特征分類并計算出百分比。(保留好玻片，下節(jié)實驗課做)大小約6-9um,雙面微凹，染粉紅色，中央有小淡染區(qū)，無細胞核，溶貧、白血病、MDS、骨纖或缺鐵貧、巨幼貧治療期會出現幼紅細胞。1.白細胞分類計數1為嗜中性分葉核，細胞胞體圓形，約10-13um，胞質豐富，染粉紅色，含較多細小均勻的淡粉紅色中性顆粒，核2-3葉居多，核間核絲相連。2為桿狀核核呈彎曲桿狀1.白細胞分類計數1.白細胞分類計數1.白細胞分類計數1為嗜中性桿狀核2為嗜酸性分葉核，細胞胞體圓形，一般分兩葉，約13-15um，胞質內充滿粗大的橘黃色顆粒。1.白細胞分類計數嗜堿性粒細胞，細胞胞體圓形，約10-12um，胞質紫紅色，內有少量粗大但大小不均的黑色嗜堿性顆粒，常覆蓋于核上。1.白細胞分類計數淋巴細胞，可分為大淋巴和小淋巴，前者直徑10-15um，圓形，胞漿豐富，內含少量嗜天青顆粒。后者直徑6-10um，胞體呈圓形，胞漿量少，染色質較固縮。1.白細胞分類計數1為單核細胞，胞體大，直徑14-20um，圓形或不規(guī)則形，胞質較多，灰蘭色，胞核大，核形不規(guī)則。2為嗜中性分葉核粒細胞。1.白細胞分類計數根據細胞大小、核形、胞漿顏色、顆粒特點等特征進行分類2.尿液分析方法學和檢測方法的類別物理檢查顏色、濁度、比重

化學成分粗篩葡萄糖（GLU）、蛋白質（PRO）、膽紅素（BIL）尿膽原（URO）、PH、紅細胞（BLD）、酮體（KET）亞硝酸鹽（NIT）和白細胞（LEU）有形成分細篩有形成份（顆粒），如：上皮細胞、血細胞結晶、管型、細菌、精子、粘液等

目視或自動分析外觀,顏色,濁度折射率儀,滲透壓儀尿干化學分析儀(手工,半自動或全自動)尿流式分析儀顯微鏡檢查和染色技術RBC、WBC、EC、CAST、BACT、P-CAST、SRC、YLC、CRYSTAL、SPERM、MUCUS、COND.紅細胞形態(tài)學信息、尿電導率分級、UTI信息UF-1000i半導體激光流式細胞/核酸熒光染色技術全新DNA/RNA染色細胞分析)草酸鈣結晶最常見的形狀是八面體形狀。這些結晶可在健康個體的酸性和中性的尿液中發(fā)現。在病理學上，草酸鈣可在嚴重的慢性腎病中發(fā)現。結晶–草酸鈣結晶(CAOX)IQ200報告結果畫面2.尿液標本采集方法2.尿液測定濕化學法--尿蛋白定性檢查

加熱醋酸法（靈敏度5~10mg/dl）

原理加熱使蛋白質變性凝固，加稀醋酸使PH下降，約達到蛋白質等電點（PH4.7左右），有利于蛋白質沉淀。加酸還可以消除因尿液受熱而出現的磷酸鹽結晶等。試劑5﹪醋酸：冰醋酸5ml，加蒸餾水至100ml方法

1.取試管1支，加清晰尿液至試管的2/3處。2.夾住試管下部，使試管傾斜，用酒精燈在尿液的上1/3處，逐漸加熱至煮沸。3.在尿液中滴加5％醋酸2～3滴，觀察結果。【判斷】：（1）：煮沸、加酸后尿液仍清晰透明者為陰性反應。（2）：煮沸后產生混濁，加酸后混濁消失而不生氣泡者為磷酸鹽。（3）：煮沸后產生混濁，加酸后混濁消失并有氣泡生成者為碳酸鹽。（4）：加酸后混濁反而增加，表示尿內含熱凝固性蛋白（白蛋白，球蛋白）。根據混濁程度，按下表判斷標準報告結果。

煮沸醋酸結果判斷標準定性結果煮沸所見蛋白約含量（g/dl）

－仍清晰，濁度不增加無

±僅在黑色背景下，有輕微混濁極微量

+白色混濁，無顆粒及絮狀沉淀0.01～0.05

++有明顯白色顆粒狀混濁，但無絮狀沉淀0.05～0.2

+++大量絮片狀混濁，一般不見出現凝快0.2～0.5

++++出現塊狀凝固，并有大量絮片狀沉淀＞0.5【參考值】陰性【注意事項】1.醋酸加的過多，PH低于蛋白質的等電點時，已經沉淀的蛋白質又可溶解，可使陽性減弱或呈假陰性。因此醋酸用量要控制在2～3滴（約50~100ul）之內。2.不要在試管下部加熱，以便用下部尿液作對比。3.如尿液中電解質含量太低（如限制食鹽的病人）時，因缺乏鹽析作用，在煮沸時蛋白質部易生成沉淀，遇此情況須先加相當于尿量1/6量的飽和鹽水溶液，混勻后再作檢查。4.應在煮沸加酸后，立即觀察結果，延長時間會影響結果的判斷?！驹怼科咸烟侨┗趬A性環(huán)境中加熱，能使二價硫酸銅還原為一價氧化亞銅，出現黃至磚紅色沉淀物?！驹噭堪嗍显噭?.尿糖定性試驗--班（Benedict）氏法（靈敏度100mg/dl）【操作】:取班氏試劑約2ml至一中試管中,煮沸。加尿液0.2ml（比例約10：1）,直接在火焰上或沸水中煮2分鐘?！九袛唷?如尿中有糖,則因糖量的不同,試劑由藍色變?yōu)辄S綠色,直至磚紅色,可根據顏色判定結果.或在放冷后,根據沉淀的程度按下述標準判定結果糖定性結果判斷表

反應表現符號大致糖量(g/dl)仍呈藍色－冷卻后有少量微綠色沉淀±煮沸2分鐘有少量綠黃色沉淀(以綠色為主)+<0.5煮沸1分鐘即有較多黃綠色沉淀（以黃為主)++0.5～1煮沸15秒,顯土黃色沉淀+++1～2開始沸騰即顯棕紅色沉淀++++>2

尿沉渣檢查是用顯微鏡或儀器對尿沉淀物進行檢查，以識別尿液中各種細胞，各類管型，粘液絲，結晶，細菌，寄生蟲等各種病理成分，是重要的常規(guī)檢驗項目。這些有形成分的識別對泌尿系統疾病的診斷、病情觀察、判斷預后有重要意義。

4.尿沉渣鏡檢尿沉渣檢驗的操作步驟標本收集隨機尿

門診、急診標本過篩試驗晨尿

尿常規(guī)檢查(特別是對蛋白、細菌、細胞及管型檢查)離心離心管中倒入充分混均的尿液10ml，2000轉，離心5分鐘。離心后傾倒上清液，留0.2ml鏡檢。鏡檢充分混勻標本，取1滴（約50ul），均勻置于玻片上用低倍鏡（10×10）觀察全片，再用高倍鏡（10×40）仔細觀察并計數各類細胞在10個視野內的最低和最高數目。在某些生理或病理情況下，沉渣尿中主要有以下幾種有形成分，現介紹如下：尿中紅細胞增多見于：a.腎病包括急、慢性腎小球腎炎、腎盂腎炎、狼倉性腎炎、腎腫瘤、腎結石、腎盂積水、多囊腎等b.下尿道疾病包括急、慢性感染，尿道狹窄、腫瘤、結石c.腎外疾病，如急、慢性胰腺炎、亞急性細菌性心內膜炎、白血病等d.磺胺藥物、水楊酸藥物引起的中毒反映活體正常紅細胞經阿利新蘭-中性紅染色，不著色或淡黃色，胞體呈現圓盤狀有折光尿液中常見紅細胞A正常紅細胞B大紅細胞C小紅細胞棘狀紅細胞尿白細胞見于膀胱炎、尿路感染、腎盂腎炎、前列腺炎等疾病

尿中常見白細胞A中性粒細胞，多見于新鮮尿液中，外形完整，圓形，漿內顆粒清晰可見，胞核清楚，常分散存在B淋巴細胞C單核細胞膿細胞團見于炎癥時，由白細胞變性、壞死粘連而成A活體中性粒細胞B膿粒細胞上皮細胞表層鱗狀上皮細胞：多見于女性尿液。移行上皮細胞：腎盂腎炎和膀胱炎時可見。腎小管上皮細胞：正常尿中無此細胞，一旦出現往往表示腎小管病變，如急性腎小管壞死性腎炎、腎病綜合癥、腎小管間質性炎癥。

表層鱗狀上皮細胞細胞較大，形態(tài)不規(guī)則，扁平似魚鱗，含有小而圓或橢圓形的核。此細胞常成堆出現。經阿利新蘭-中性紅染色，核呈紫紅色，胞漿紅色。

中層移行上皮細胞體積大小不一，常呈梨形、紡錘形或帶尾形，又名尾形上皮細胞。核較大呈圓或橢圓形。

底層移行上皮細胞體積較小，形態(tài)較圓，和腎小管上皮細胞統稱為小圓上皮細胞。底層移行上皮細胞核相對較小，整個胞體較腎小管上皮細胞為大。腎小管上皮細胞腎小管上皮細胞群，由多個腎小管上皮細胞組成，形似管型。

管型透明管型:在正常人清晨濃縮尿中偶可見到，在激烈運動后、高熱、全身麻醉等情況下，可一過性出現，腎小球腎炎時，可見明顯增多。顆粒管型：增多時表示腎有實質性病變。細顆粒管型:多見于腎小球腎炎，少數可見于無腎臟疾病者尿中，特別在運動后，發(fā)熱或脫水時。粗顆粒管型:多見于慢性腎小球腎炎、腎病綜合癥時。細胞管型:1.紅細胞管型：常見于急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎急性發(fā)作期、急性腎小管壞死、腎出血、腎移植術后急性排斥反應。2.白細胞管型：提示腎有炎性變化，多見于腎盂腎炎或急性腎炎。3.腎小管上皮細胞管型：各種原因所致腎小管損傷時出現，如急性腎小管壞死、腎淀粉樣變性、腎移植后排斥反應。脂肪管型:可見于腎病綜合癥、慢性腎小球腎炎急性發(fā)作、腎小管中毒等。蠟樣管型:出現時表示腎臟有長期而嚴重的病變，見于慢性腎炎晚期、腎衰竭和腎淀粉樣變時。紅細胞管型可見未完全溶解的紅細胞紅細胞管型管型內紅細胞呈圓盤、氣泡狀，大小不一白細胞管型管型內充滿白細胞，一般為中性粒細胞，呈球形。因白細胞黏附性強，過多時呈集團性粘合，有時白細胞破碎呈顆粒狀。白細胞管型A白細胞管型B紅細胞C小圓上皮細胞透明管型可見黏附少量白細胞，應與白細胞管型區(qū)別上皮細胞管型管型內含有腎小管上皮細胞，但大部分已變性，細胞大小不一。尿液中如大量出現上皮細胞管型，表示腎小管有病變和腎小管腔受到阻塞。細顆粒管型管型較長而窄，內含有許多細顆粒，不透明。管型內顆粒主要是腎上皮細胞的分解產物，開始顆粒大而粗，再降解為細顆粒粗顆粒管型橘黃色，顆粒粗大，出現于膽紅素尿液中結晶尿是機體的代謝產物，大量的無機鹽隨尿液排出體外，維持機體的酸堿平衡。尿中折出的各種無機鹽類主要取決于這些物質在尿液中的溶解度.濃度.PH，溫度及藥物等因素的影響。當任何一種因素失衡時，可有鹽類或結晶析出，大量時可使尿液混濁。尿中鹽類及結晶可分為三類：1.酸性尿液：（PH＜6.0)常見的結晶為尿酸結晶，草酸鈣，硫酸鈣及各種氨基酸結晶和膽固醇結晶；鹽類為非結晶性尿酸鹽。在新鮮尿液中如大量出現酸性尿結晶，特別是尿酸和草酸鈣結晶又伴有紅細胞時，多為腎或膀胱，輸尿管結石。2.堿性尿液：（PH＞8.0）常見的結晶為磷酸鈣，碳酸鈣，尿酸銨，尿酸鈣和非結晶形磷酸鹽。這類結晶一般無臨床意義。3.藥物結晶：一種無定形的結晶，特別為磺胺類藥物，如大量持續(xù)出現磺胺類結晶時，并同時有紅細胞，管型存在，多表示腎已受磺胺類藥物損害，應立即停用磺胺藥。

尿酸結晶草酸鈣結晶

為折光性強的八面體，兩條對角線在中間交叉，大小不一，邊緣較厚。如同時伴有較多紅細胞時應考慮有尿結石可能。尿粘液絲及其他成份尿粘液絲：形狀呈長絲狀，粗細不等，邊緣不整齊，兩端尖細也可一端尖細，彎曲，易誤認為管型，應引起重視。正常人尿中少見，出現大量粘液絲時，表示尿道受刺激或有炎癥反應。其他成份：尿液沉渣中有時還可發(fā)現霉菌，滴蟲，精子等有形成分，這也應引起注意。束狀黏液絲可見于正常人尿中，尤其是女性尿中。大量出現表示尿道受刺激或有炎癥反應真菌孢子西瓜子樣，圓形或橢圓形，不著色或微綠色，折光性強，大小不一。真菌菌絲菌絲呈樹枝狀生長，有折光性雙球菌球菌成雙排列精子A精子B白細胞C紅細胞桿菌(左)、球菌(中)、霉菌孢子(右)[報告方式]

5.腦脊液蛋白質定性試驗

潘氏（Pandy‘s）試驗原理

腦脊液中球蛋白與苯酚結合，形成不溶性蛋白鹽而產生白色混濁或沉淀。生理狀態(tài)下，由于血腦屏障的作用，只允許少量白蛋白進入腦脊液，因此，正常腦脊液有時也可呈弱陽性反應。試劑5%—7%苯酚液方法

取飽和苯酚溶液2mL于試管內，加腦脊液一滴，于黑色背景下觀察。