第三章-基因工程的載體復(fù)習(xí)課程

第二章基因工程的載體(zàitǐ)和工具酶第一節(jié)載體(zàitǐ)第一頁，共36頁。引言基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴增和表達，而目的基因本身無法進行復(fù)制和表達、不易進入受體細(xì)胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來實現(xiàn)。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：⑴載體必須是復(fù)制子。⑵具有合適的篩選標(biāo)記，便于重組(zhònɡzǔ)子的篩選。⑶具備多克隆位點（MCS），便于外源基因插入。⑷自身分子量較小，拷貝數(shù)高。⑸在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高。第二頁，共36頁。一、質(zhì)粒載體(zàitǐ)（plasimidvectors）（一）質(zhì)粒載體(zàitǐ)的生物學(xué)特性（二）質(zhì)粒載體(zàitǐ)的制備（三）質(zhì)粒載體(zàitǐ)的改造第三頁，共36頁。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性(tèxìng)（1）質(zhì)粒是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制(fùzhì)的裸露的雙鏈環(huán)狀(少數(shù)為線形和RNA）DNA分子。廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別(tèbié)是大腸桿菌的質(zhì)粒。大腸桿菌的質(zhì)粒主要有F質(zhì)粒（F因子）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）和Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）三種。第四頁，共36頁。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性(tèxìng)（2）質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達到200kb。（3）質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞(xìbāo)中“友好”地“借居”，離開了寄主它本身無法復(fù)制；同時質(zhì)粒往往有宿主專一性，如大腸桿菌的復(fù)制起點不一定能在其它生物細(xì)胞(xìbāo)中繁殖。第五頁，共36頁。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性(tèxìng)（4）質(zhì)粒的復(fù)制類型一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞(xìbāo)中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stigentplasmid）,拷貝數(shù)為1-3；“松弛型”質(zhì)粒（relaxedplasmid）,拷貝數(shù)為10-60。不過即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞(xìbāo)間和不同的生長環(huán)境也可能有很大的變化。（5）質(zhì)粒的不親和性兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞(xìbāo)中穩(wěn)定共存。載體質(zhì)粒與受體的質(zhì)粒應(yīng)是不同的不親和群。第六頁，共36頁。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性(tèxìng)⑹質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)

接合型質(zhì)粒分子量大嚴(yán)緊(yánjǐn)型復(fù)制

非接合型質(zhì)粒分子量小松弛型復(fù)制

是否含有接合轉(zhuǎn)移基因

非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，不含tra基因；可以為轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒所帶動轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，含有tra基因；能通過結(jié)合作用從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：第七頁，共36頁。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性(tèxìng)（7）質(zhì)粒的存在形式(xíngshì)有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價閉合環(huán)（SC構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋（OC構(gòu)型）線狀雙螺旋（L構(gòu)型）第八頁，共36頁。（二）質(zhì)粒DNA的制備(zhìbèi)有多種分離質(zhì)粒的方法(fāngfǎ)，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過濾法等。目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒DNA。這個方法(fāngfǎ)主要包括培養(yǎng)收集細(xì)菌菌體，裂解細(xì)胞，將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開及除去蛋白質(zhì)和RNA。第九頁，共36頁。堿變性法質(zhì)粒提取的原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。在pH值12.0～12.5范圍內(nèi)時，線性的DNA會被變性而共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會被變性。通過冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速(xùnsù)復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。第十頁，共36頁。堿變性法提取質(zhì)粒的步驟：1、取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞(xìbāo)沉淀；2、加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA）渦旋震蕩懸浮菌液。3、加入200微升新配制的溶液II，（0.2MNaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。4、加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸鉀29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸餾水至100毫升）顛倒離心管10次后，冰浴5分鐘。5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA。第十一頁，共36頁。（三）質(zhì)粒載體(zàitǐ)的改造⑴去掉不必要的DNA區(qū)段。⑵減少限制酶的識別位點，一種酶只保留一個。（單一的限制性酶切位點）。⑶加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。⑷對質(zhì)粒進行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移。⑸改造或增加(zēngjiā)基因表達的調(diào)控序列。第十二頁，共36頁。1、質(zhì)粒pBR322

pBR3224363結(jié)構(gòu)：（1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr）3種限制酶單一識別位點。（2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr）內(nèi)部有7種，啟動(qǐdòng)區(qū)內(nèi)有2種限制酶單一識別位點。（3）DNA復(fù)制起點（ori）第十三頁，共36頁。pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點：（1）具有較小的分子量。4363bp，2.6×106Da，（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)子的選擇記號。（3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后,每個細(xì)胞中可累積1000～3000個拷貝。（4）對多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個能切割的位點。pBR3224363第十四頁，共36頁。外源DNApBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端(mòduān)黏性末端(mòduān)連接酶重組子(ampstetr)空載體(zàitǐ)(amprtetr)插入子(ampstets)野生型的E.coli(ampstets)

導(dǎo)入涂布在含Tc的平板上重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr)空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)影印在含Ap的平板上空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)因插入外源DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng)對比兩個平板上的菌落，凡在Tc平板上生長而在Ap平板上不能生長的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。第十五頁，共36頁。第十六頁，共36頁。2、pUC質(zhì)粒載體(zàitǐ)1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術(shù)(jìshù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的結(jié)構(gòu)：（1）來自于pBR322的Ori（2）氨芐青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列發(fā)生了變化（3）LacZ′基因編碼β—半乳糖酶的α—肽鏈即氨基末端。（4）MCS區(qū)段是一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點在整個(zhěnggè)載體中是唯一的。第十七頁，共36頁。2、pUC質(zhì)粒載體(zàitǐ)與pBR322相比，pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點：（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)如pUC8為2750bp，pUCl8為2686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個細(xì)胞即可達500～700個拷貝（2）適用于組織化學(xué)法檢測重組體通過-互補(hùbǔ)作用，利用菌落顏色篩選重組子。（3）具有多克隆位點區(qū)段（MCS）可以定向克隆防止載體自我連接。第十八頁，共36頁。-互補(alpha-complementation)大腸桿菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且釋放出一種藍色物質(zhì)，當(dāng)該酶的-片段和-片段分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶-片段的LacZ’基因插入到載體的多克隆位點的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的片段。這樣一來，含有功能性完整的LacZ’基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時，載體編碼的-片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補并具有了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象(xiànxiàng)被成為是alpha-complementation.X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第十九頁，共36頁。

釋放(shìfàng)出的藍色物質(zhì)可以將整個菌落染成藍色，非常容易辨別，如果LacZ’插入外源基因被破壞，菌落則是無色的。組織化學(xué)法檢測(jiǎncè)重組體X-Gal-半乳糖苷酶IPTG誘導(dǎo)(yòudǎo)物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷

半乳糖

5-溴-4-氯-靛藍＋第二十頁，共36頁。二、噬菌體載體(zàitǐ)（phagevectors）（一）噬菌體載體(zàitǐ)（二）M13噬菌體載體(zàitǐ)（三）柯斯質(zhì)粒載體(zàitǐ)第二十一頁，共36頁。1.噬菌體的生物學(xué)特性(tèxìng)溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。溶源周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進行復(fù)制。整合了一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌(xìjūn)被稱為溶源性細(xì)菌(xìjūn)。在溶源性細(xì)菌(xìjūn)內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體。噬菌體溫和噬菌體，具有(jùyǒu)溶源生長周期和溶菌生長周期烈性噬菌體,只具有溶菌生長周期第二十二頁，共36頁。1.噬菌體的生物學(xué)特性(tèxìng)第二十三頁，共36頁。2.噬菌體的生物學(xué)特性(tèxìng)第二十四頁，共36頁。2.噬菌體的生物學(xué)特性(tèxìng)⑴組成：蛋白質(zhì)外殼和線狀雙鏈DNA分子(fēnzǐ)組成。DNA長度為48502bp，在分子(fēnzǐ)兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子(fēnzǐ)。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點（cohesiveendsite）.GGGCGGCGACCT第二十五頁，共36頁。2.噬菌體的生物學(xué)特性(tèxìng)⑵是一個溫和噬菌體一般以溶源生長進行增殖，脅迫條件下也會進入溶菌生長周期。⑶復(fù)制溶源周期隨溶源細(xì)菌染色體一起復(fù)制溶菌周期的早期是“θ”復(fù)制，晚期進行滾環(huán)復(fù)制⑷基因組成DNA至少包括61個基因，大多(dàduō)基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分約1／3為非必須區(qū)段。第二十六頁，共36頁。λ噬菌體載體(zàitǐ)類型置換型（Replacementvectors）這種載體具有兩個對應(yīng)(duìyìng)的酶切克隆位點，在兩個位點之間的λDNA區(qū)段是λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon4載體克隆能力大，20～25kb插入型（Insertionvectors）這種載體僅僅(jǐnjǐn)有一個可供外源DNA插入的克隆位點。如：λgt10、λgt11克隆能力小，不到10kb噬菌體載體的類型第二十七頁，共36頁。①Insertionvectors第二十八頁，共36頁。②Replacementvectors

置換(zhìhuàn)型載體第二十九頁，共36頁。（二）M13噬菌體1、絲狀噬菌體M13噬菌體的生物學(xué)特性⑴是單鏈閉合環(huán)狀噬菌體只能(zhīnénɡ)感染雄性細(xì)菌，外形成絲狀，基因組DNA長約6.4kb，可分為10個區(qū)和507bp基因間隔區(qū)（IS區(qū)），該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈DNA載體的重要前提。⑵復(fù)制與增殖（圖）第三十頁，共36頁。M13噬菌體的復(fù)制(fùzhì)與增殖“＋”DNACPCP脫落(tuōluò)，“＋”DNA復(fù)制RF－DNA“θ”型復(fù)制(fùzhì)積累200～300份滾環(huán)復(fù)制＋SSB外溢時被包裝M13噬菌體第三十一頁，共36頁。2.M13噬菌體載體(zàitǐ)的構(gòu)建這類載體的突出優(yōu)點在于(zàiyú)其既可以提供單鏈DNA，也可以提供雙鏈的DNA。其最大的不足在于(zàiyú)插入大的DNA片段后表現(xiàn)不穩(wěn)定，在噬菌體增殖過程中容易發(fā)生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之內(nèi)，克隆300-400bp的片段十分穩(wěn)定。

⑴在IS區(qū)內(nèi)插入LacZ基因⑵在標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)組裝MCS區(qū)段所以(suǒyǐ)能通過互補在X-Gal/IPTG平板上識別重組體。這類載體包括了M13mp8、9和M13mp18、19等。第三十二頁，共36頁。（三）柯斯質(zhì)粒載體(zàitǐ)（cosmidvectors）柯斯質(zhì)粒載體(zàitǐ)的特點柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，cosmid是cossitecarryingplasmid的縮寫(suōxiě)?？滤官|(zhì)粒的大小為4-6kb，由3部分組成：A.多克隆位點區(qū)B.含有cos位點的DNA區(qū)C.復(fù)制起始位點和抗性標(biāo)記區(qū)pHC79OriMarkerMCScosDNA第三十三頁，共36頁。（三）柯斯質(zhì)粒載體(zàitǐ)（cosmidvectors）柯斯質(zhì)粒載體的特性1、具有噬菌體的特性柯斯質(zhì)粒連接上適宜長度(chángdù)的外源DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主細(xì)胞。進入寄主細(xì)胞的DNA也能環(huán)化和復(fù)制，但是不會形成新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。2、具有質(zhì)粒載體的特性能象質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)