實驗一-核酸的提取學習資料

分子生物學實驗(shíyàn)

Experimentsofmolecularbiology授課(shòukè)教師：田生禮實驗一核酸(hésuān)的提取第一頁，共28頁。實驗一核酸(hésuān)的提取

（質粒DNA的提取和純化）【目的要求】1．學習載體的基本結構2．了解堿裂解法質粒提取過程中各步驟的設計(shèjì)思想；3．掌握堿裂解法提取質粒的原理方法和各項基本技術；第二頁，共28頁。【實驗(shíyàn)原理】堿裂解法提取質粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全(wánquán)分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。第三頁，共28頁。【實驗材料和用品】恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、臺式離心機、高壓滅菌鍋、Enpendorf管、含有目的基因(jīyīn)pADH的PMD-20T質粒的大腸桿菌、堿裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE緩沖液、胰RNA酶。注：pADH為多頭絨泡菌乙醇脫氫酶第四頁，共28頁?！緦嶒灢襟E】1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。

5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。

6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。

7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。

8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有(suǒyǒu)液體流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。

9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。

10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，37℃金屬浴一個小時，然后儲于-20℃冰箱中。第五頁，共28頁。質粒電泳圖第六頁，共28頁。核酸的分離(fēnlí)與純化不論是基因工程還是蛋白質工程，核酸分子是這些技術應用所涉及的主要對象，所以核酸的分離(fēnlí)與提取是生化與分子生物學研究中非常重要的基本技術。核酸樣品的質量將直接關系到實驗的成敗。第七頁，共28頁。核酸的種類(zhǒnglèi)：真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子；真核細胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；原核生物的基因組DNA、質粒DNA為雙鏈環(huán)狀分子；RNA分子在大多數(shù)生物體內均是單鏈線性分子；不同類型的RNA分子可具有不同的結構特點，如真核mRNA分子多數(shù)在3’端帶有ploy(A)結構;tRNA的三葉草結構。病毒的DNA、RNA，其存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀和單鏈線狀等。第八頁，共28頁。一、核酸分離(fēnlí)提取的原則分離純化(chúnhuà)核酸總的原則①應保證核酸一級結構的完整性；②排除其它分子的污染，保證較高純度。第九頁，共28頁。3.為了保征分離核酸的完整性和純度，在實驗過程中，應注意以下事宜：①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞(pòhuài)；②減少化學因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞(pòhuài)，操作多在pH4-10條件下進行；第十頁，共28頁。③減少物理因素對核酸的破壞，物理破壞因素主要是機械剪切力，其次是高溫。④防止核酸的生物降解，細胞(xìbāo)內或外界的各種核酸酶（DNA酶、RNA酶）酶解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結構。第十一頁，共28頁。其中(qízhōng)DNA酶，需要金屬二價離子Mg2+，Ca2+的激活，使用金屬二價離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸鹽，基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶，不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素。第十二頁，共28頁。提取高質量基因組DNA的主要用途：PCR擴增的模板(múbǎn)用于構建基因組文庫用于Southernblot雜交分析二、真核細胞染色體DNA的制備(zhìbèi)第十三頁，共28頁。1.真核細胞的破碎（1）物理方式:超聲波法、勻漿(yúnjiānɡ)法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。這些物理操作均可導致DNA鏈的斷裂。（2）為了獲得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污劑溫和處理法。真核細胞染色體DNA的制備(zhìbèi)過程第十四頁，共28頁。2.去除蛋白質常用酚、氯仿抽提。反復的抽提操作對DNA鏈的機械剪切機會較多，所以有人使用高濃度甲酰胺解聚核蛋白聯(lián)合透析的方法，可以獲得200kb以上的DNA片段，適用于粘粒(cosmid)構建基因組文庫。根據(jù)(gēnjù)不同的實驗要求，可選擇不同的實驗方法制備真核細胞染色體DNA。第十五頁，共28頁。3.DNA沉淀：一般(yībān)采用2倍體積乙醇沉淀或用異丙醇（0.6）4.DNA溶解：一般(yībān)采用TE第十六頁，共28頁。從細胞中分離RNA的純度與完整性對于許多分子生物學實驗至關重要。如Northernblot及cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上決定(juédìng)于RNA的質量。三、RNA的分離(fēnlí)與純化-真核細胞RNA的制備第十七頁，共28頁。RNA主要由以下幾類分子組成：rRNA(占RNA總量的80％—85％)、tRNA和核內小分子RNA(占10％-15％)、mRNA(占1％～5％)。rRNA在總RNA分子中含量最豐富，由28S、18S、5S及4S幾類組成，它們之間同源性大，分子量變化不大，所以可根據(jù)它們的密度(mìdù)和分子大小，通過密度(mìdù)梯度離心，凝膠電泳或離子交換層析進行分離。第十八頁，共28頁。mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，在細胞中含量少，絕大多數(shù)mRNA分子(除血紅蛋白及有些組蛋白mRNA以外)，均在3’端存在20-250個多聚腺核苷酸poly(A)。利用(lìyòng)此特征，可很方便地從總RNA中，用寡聚(dT)親和層析柱分離mRNA。mRNA分子群體編碼細胞內所有的多肽和蛋白質，而mRNA是分子生物學的主要研究對象之一。第十九頁，共28頁。鑒定所提取總RNA分子(fēnzǐ)的質量，可以通過瓊脂糖電泳后觀察是否有明顯得28S、18S條帶來判斷。第二十頁，共28頁。Fig.1TotalRNAisolatedfromTrichodermareeseiinducedbydifferentinducers圖1.木霉總RNA的分離1.微晶(wēijīnɡ)纖維素2.天然稻草粉第二十一頁，共28頁。如何創(chuàng)造一個(yīɡè)無RNase的環(huán)境？RNA分離的關鍵因素是：盡量減少RNA酶的污染！極力避免外源RNase的污染：主要來源于操作者的手、實驗的器皿和試劑盡力抑制內源性RNase的活力：主要來源于樣品中的組織細胞。第二十二頁，共28頁。怎樣去除外源性RNase的污染？(1)操作者的手直接觸摸之處，毫無疑問會留下RNase，說話帶出的唾液也富含RNase。故整個操作過程中，應戴口罩和手套。(2)空氣中飛塵(fēichén)攜帶的細菌、霉菌等微生物，也是污染外源RNase的一條途徑，所以操作過程應在比較潔凈的環(huán)境中進行。第二十三頁，共28頁。(3)玻璃器經(jīng)過常規(guī)洗凈后，應用0.1％焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)浸泡處理(37℃，2小時)，再用雙蒸滅菌水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后200℃烘烤4小時以上或180℃烘烤過夜。(4)塑料器材最好(zuìhǎo)使用滅菌的一次性塑料用品，Eppendorf管、微量加樣吸頭最好(zuìhǎo)是新的，使用前進行高壓蒸汽消毒。第二十四頁，共28頁。如何抑制內源性RNase的活性？要盡可能早地去除細胞內蛋白，加入RNase抑制劑，力爭(lìzhēng)在提取的起始階段對RNase活力進行有效地抑制。

第二十五頁，共28頁。RNase抑制物：（1）低特異性RNase抑制物：不同類型的低特異性RNase抑制物均可不同程度地抑制Raise的活性，其中包括(bāokuò)DEPC皂土(bentonite):Al2O3·4SiO2·H2O復合硅酸鹽(Macaloid)肝素氧釩基—核苷復合物多胺第二十六頁，共28頁。（2）去除蛋白質的物質：蛋白質變性劑：酚、氯仿；尿素蛋白酶K去污劑：SDS、十二烷酰肌氨酸鈉(sarkosyl)、脫氧膽酸鈉(DOC)是陰離子去污劑解偶劑(胍類)：鹽酸胍、異硫氰酸胍是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質，并使蛋白質二級