色譜柱介紹講課教案

色譜柱介紹1.色譜柱填料二、聚合物基質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：1.PH穩(wěn)定性好1-132.可進(jìn)行表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求.3.在中等

pH

條件下對(duì)強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。缺點(diǎn)：1.孔徑結(jié)構(gòu)復(fù)雜，孔徑不均勻，導(dǎo)致柱效不夠高

2.有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲或受損。優(yōu)點(diǎn)：1.目前應(yīng)用最廣泛的基質(zhì)材料

2.具有高機(jī)械強(qiáng)度和高的比表面積

3.在中等

pH

條件下對(duì)強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。

4.高效、重現(xiàn)性好

5.可利用直接的廣泛的表面健合反應(yīng)來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。三、硅膠基質(zhì)缺點(diǎn)：1.硅膠基質(zhì)的PH范圍是3-8，在高或低的

pH下都容易溶解。

2.具有容易導(dǎo)致強(qiáng)堿性物質(zhì)拖尾的表面活性和帶酸性的硅羥基1.色譜柱填料2.1）硅膠純度定義：填料硅膠的純度與殘留金屬的離子濃度。硅膠純度對(duì)強(qiáng)極性化合的分離最重要。A

型硅膠（純度較低）：金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可用作中性化合物和非離子化合物的分離。由于帶負(fù)電荷的殘留硅羥基和酸性表面上金屬含量高，（硅羥基的PKa低），導(dǎo)致堿性化合物發(fā)生拖尾。2.色譜柱物理性能2.色譜柱物理性能B

型硅膠：純度高、酸性較弱的硅膠。這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬可用于分離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化和物。2.2）色譜柱的尺寸柱的長度和內(nèi)徑短柱（15-100mm)運(yùn)行時(shí)間短，柱壓低長柱（150-250mm)分辨率高，運(yùn)行時(shí)間長窄徑柱（≤2.1mm）檢測器靈敏度高寬徑柱（3-21.2mm)載樣量高2.3）顆粒形狀球型或無定型當(dāng)使用黏度較大的流動(dòng)相時(shí)，球型顆粒可降低柱壓，延長色譜柱壽命。1.球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結(jié)構(gòu)均勻，柱效高，重現(xiàn)性好；2.無定形填料平均孔徑分布較寬，柱床結(jié)構(gòu)不均勻，流動(dòng)相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)寬。

2.色譜柱物理性能粒徑作用和效能5μm目前應(yīng)用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離3–3.5μm常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑<2μm常應(yīng)用于超快速分離，highthroughput,分離度高7–10μm常用于半制備色譜柱10–20μm常用于制備色譜柱2.4）粒徑粒徑是指柱填料的顆粒直徑的大小。實(shí)際上色譜柱上所標(biāo)的粒徑是一個(gè)平均值通常3-10μm平均粒徑越小，顆粒分布度越小，色譜柱效越高，反壓亦越高。

2.色譜柱物理性能2.5）表面積定義：顆粒外表面與內(nèi)部孔面積的總和，以m2/g表示高表面積對(duì)于多組分樣品的分離具有較強(qiáng)的保留能力、柱容量和分離度。表面積低的填料通常能迅速達(dá)到平衡，對(duì)于梯度洗脫尤為重要。2.色譜柱物理性能2.6）孔徑定義：是指填料顆粒的孔或腔的平均尺寸，范圍80-300?大孔的填料顆粒，可以延長溶質(zhì)大分子在填料表面滯留的時(shí)間，達(dá)到充分分離，改善峰形。較小的孔徑提供較高的表面積，可用于較大的載荷量，并保留小的有機(jī)化合物，這種填充柱可用于小分子有機(jī)物到聚合物的分離

樣品MW<4000,選擇80?的孔徑；樣品>4000,選擇300?的孔徑2.色譜柱物理性能3.色譜柱化學(xué)性能

3.1鍵合類型單鍵鍵合—鍵合相分子與基體單鍵相連單齒鍵合提高傳質(zhì)，加快色譜柱平衡。聚合體鍵合—鍵合相分子與基體多點(diǎn)相連雙齒鍵合，增加色譜柱穩(wěn)定性，增加色譜柱的載樣量。填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。

3.2碳含量高碳覆蓋率，提高分辨率，分析時(shí)間長。低碳覆蓋率，縮短運(yùn)行時(shí)間?？梢酝ㄟ^增加碳鍵的長度或增加鍵合密度來增加碳含量。含碳量增高了，利于不易保留化合物的分離

定義：碳含量即填料中的含碳量。傳統(tǒng)的測量技術(shù)是將填料加熱到碳?xì)滏I斷裂，然后通過測定損失的重量或形成的二氧化碳來計(jì)算碳含量。

但是不能單獨(dú)以碳含量來預(yù)測色譜行為，它還與硅膠的密度、鍵合相的密度填料的表面積等等有關(guān)系。

3.色譜柱化學(xué)性能

3.3封端減輕待測組分與硅膠表面殘留的酸性羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象，對(duì)于極性樣品，未封端與經(jīng)過封端處理的色譜柱在選擇上有明顯差異。適用范圍：低PH（1-8）值下，分析酸性、中性組分堿性化合物易產(chǎn)生二次保留，引起拖尾。3.色譜柱化學(xué)性能

適用范圍：中等PH（2-9）值下，分析酸性，堿性和中性組分，尤其堿性組分峰形優(yōu)異，柱壽命長。端基封尾可改善對(duì)極性化合物的吸附或拖尾

3.色譜柱化學(xué)性能

柱規(guī)格的選擇直接影響分析速度、分離能力、檢測能力及每次分析的溶劑消耗等。

柱規(guī)格包括兩方面：柱長和柱內(nèi)徑。

對(duì)相同的分析時(shí)間和分離度來說：內(nèi)徑大的柱子比內(nèi)徑小的柱子多消耗溶劑。較小內(nèi)徑的柱子對(duì)相同的檢測信號(hào)來說所需樣品量亦較少。因此，在樣品量有限時(shí)，可使用小內(nèi)徑柱。柱長度增加雖可改善分離效果，但阻力也隨之增加，必須提高入口壓力。長柱可以給出高分離度，短柱可提供快速分離，我們可以根據(jù)樣品情況去選用合適的色譜柱。3.色譜柱化學(xué)性能

類

型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm)粒徑

(μm)微

孔

柱0.1,0.2115,253-8分

析

柱0.3–0.463-253-10半制備柱0.8–1.010-255-20制

備

柱2.0–5.010-255-20用窄的內(nèi)徑，小的粒徑會(huì)引起高柱壓，柱壓是同時(shí)影響增加分離度和減少分析時(shí)間的主要障礙。分離度、分析時(shí)間及柱壓三者相互制約，選擇好其中兩者，則第3個(gè)因素也就選好了常見規(guī)格色譜柱：3.色譜柱化學(xué)性能

4.常見色譜柱介紹YMC-packODS-A150*4.6mmS-5um品牌C18RP18親水性AQ柱長柱內(nèi)徑粒徑球型4.1色譜柱上的信息4.2C18,C8和C4柱定義：在硅膠上鍵合C18,C8和C4的烷基碳鏈

不同點(diǎn)：碳載量不同，C18的載碳量幾乎是C8的一倍，C4的載碳量最低。相同點(diǎn)：分離機(jī)理相同。適用點(diǎn)：C18對(duì)非極性化合物保留能力強(qiáng)。

C8、C4的碳鏈較短，對(duì)非極性化合物的保留要比C18

弱，所以對(duì)強(qiáng)保留的化合物可用C8、C4代替。另外由于鏈長短的關(guān)系，C18與C8、C4在分離不同分子大小的物質(zhì)時(shí)會(huì)有選擇上的差異。4.常見色譜柱介紹C18柱定義：C18,簡稱“ODS”柱，即十八烷基鍵合硅膠填料。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70-80%的分析任務(wù)。由于C18是長鏈烷基鍵合相有較高的碳含量和更好的疏水性，對(duì)各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，應(yīng)用最為廣泛。4.常見色譜柱介紹(1)選用經(jīng)過烷基化處理封口的填料可防止堿性化合物的拖尾現(xiàn)象。(2)選用含碳量高的柱子，增加保留值。(3)選用較短的柱子(如15cm，7.5cm)，提高分離效率。(4)選用小顆粒度的填料，提高分離度。(5)對(duì)分子量大的組分選用大孔徑填料的柱子。C18柱選用的基本原則4.常見色譜柱介紹C8、C4柱C8、C4等短鏈烷基鍵合相適合做極性小以減弱保留，縮短分析時(shí)間。另一方面又可以分析氨基酸，小肽等生物分子。4.常見色譜柱介紹4.3苯基柱柱上鍵和固定相有苯基，也屬于反相柱，不過由于苯基有不同的物理特性，例如空間位阻，具有π電子，所以對(duì)某些化合物有較好的分離。與C18、C8和C4相比，苯基與帶芳香環(huán)化合物形成p-p共軛相互作用，增強(qiáng)此類化合物的相對(duì)保留。這種優(yōu)良的選擇性與對(duì)非極性化合物保留能力較弱的特點(diǎn)相結(jié)合，使得-Phenyl相成為分離、分析同時(shí)含極性和非極性復(fù)雜混合物的最佳選擇。4.常見色譜柱介紹苯基柱的特點(diǎn)：1.苯基具有獨(dú)特的空間位阻特性，對(duì)某些化合物有較好的分離。2.與C18,C8相比，有π電子的苯基能增加帶芳香環(huán)的化合物的保留3.與C18,C8相比，苯基柱對(duì)一般非芳香族的化合物保留要弱4.苯基柱是分離、分析同時(shí)含極性和非極性復(fù)雜混合物的最佳選擇苯基柱的適用范圍：1.用于分析芳香族化合物，對(duì)這類化合物有獨(dú)特的分離性。2.可以分析小分子的肽類和蛋白。4.常見色譜柱介紹4.4氰基柱氰基柱，既可用于正相色譜，又可用于反相色譜。其在用于正相色譜時(shí)，可使用如正己烷的低極性流動(dòng)相，在用于反相色譜時(shí)，可使用甲醇或水的強(qiáng)極性流動(dòng)相。CN的親脂性在反相色譜固定相中相對(duì)較低，并且由于具有π-電子作用腈基，其與ODS相比顯示出不同的選擇性。適用于在ODS上分離時(shí)間太長的組分的分離，以及在ODS上最優(yōu)化色譜非常困難的場合。

4.常見色譜柱介紹氰基柱的特點(diǎn)：1.氰基屬于中等極性基團(tuán)，正相、反相都能應(yīng)用，但選用不同分離模式時(shí)，洗脫的次序會(huì)不同。2.氰基柱可代替硅膠柱，氰基柱比硅膠柱更易快速平衡，表面活性比非衍生硅膠更一致，具有更好的重現(xiàn)性。3.獨(dú)特的π-電子作用氰基，可以同時(shí)使樣品中含有親水性及疏水性化合物的化合物有很好的分離。4.在ODS柱中需要做梯度洗脫的，用氰基柱大部分不再需要。4.常見色譜柱介紹氰基柱的適用范圍：1.做為反相色譜柱，極性最強(qiáng),所以當(dāng)分析在C18上保留太強(qiáng)峰很難看的樣品時(shí)，可用氰基柱。2.CN的柱子適合用于C18柱子出峰早，極性大。3.獨(dú)特的π-電子作用氰基，可以同時(shí)使樣品中含有親水性及疏水性化合物的化合物有很好的分離。4.常見色譜柱介紹使用氰基柱注意事項(xiàng)：1.同一根氰基柱最好在同一種體系中使用，交替調(diào)換正相、反相會(huì)迅速縮短色譜柱的使用壽命。2.在不得已情況下要正相、反相調(diào)換時(shí)，需要用異丙醇過渡。4.常見色譜柱介紹4.4氨基柱1.氨基柱是一種不太穩(wěn)定的柱子，并不是常用柱，這是因?yàn)殒I合的氨丙基很容易水解。2.正相、反相都可以使用。氰基柱的特點(diǎn)：4.常見色譜柱介紹氨基柱的適用范圍：1.在反相系統(tǒng)中，氨基柱的保留較弱，一般用于烴類、石油餾分的分離、分析。2.在正相系統(tǒng)中，通常在氰基柱無法分離重疊峰時(shí)才考慮使用氨基柱。使用氨基柱注意事項(xiàng)：1.作為反相柱時(shí)，要注意流動(dòng)相的pH范圍，pH越低越容易水解；流行相中水的比例越高，也越容易發(fā)生水解。2.長期不用時(shí)，要清洗后保存在純的有機(jī)相中。分析完酸性物質(zhì)后，氨基有可能被質(zhì)子化，導(dǎo)致柱效下降，可以用含

0.5%NH3.H2O50-50的乙腈-水沖洗該柱，沖洗后再用不含有堿的流動(dòng)相洗去多余的氨。4.常見色譜柱介紹AgilentStableBond1.PH范圍：1-82.使用了空間位阻大的硅烷3.未封端優(yōu)點(diǎn)：可以在低PH下分析酸性、堿性和中性組分，峰形優(yōu)異。5.不同品牌色譜柱介紹側(cè)鏈基團(tuán)：二異丁基或二異丙基提供空間位阻可避免硅膠在低PH下水解、破壞。AgilentAgilentEclipseXDB,1.致密鍵合了二甲基烷基硅烷2.雙封端3.PH范圍：2-9

優(yōu)點(diǎn)：可以在中等PH下分析酸性、堿性和中性組分，峰形優(yōu)異，柱壽命長.5.不同品牌色譜柱介紹AgilentBonus-RP,1.嵌入極性基團(tuán)2.使用空間位阻大的硅烷3.三封端4.PH范圍：2-9

優(yōu)點(diǎn)：可以在中等PH下分析酸性、堿性和中性組分，可用于100%全水相，峰形優(yōu)異，柱壽命長.5.不同品牌色譜柱介紹AgilentExtend-C18,1.采用獨(dú)特的雙齒鍵合結(jié)構(gòu)2.雙封端3.pH范圍:2-11.5

優(yōu)點(diǎn)：可以在中高PH下分析酸性、堿性和中性組分，尤其堿性組峰形優(yōu)異，柱壽命長。5.不同品牌色譜柱介紹Waters1.XTerraXTerra是一種超越極限的色譜柱,其填料是利用先進(jìn)的無機(jī)、有機(jī)雜化顆粒技術(shù)由兩種高純單體合成的高純硅膠填料。傳統(tǒng)硅膠填料有大量裸露的OH1.大量的-CH3有機(jī)硅烷單元2.-OH硅羥基數(shù)量大大減少3.骨架分布均勻SurfacecoreSurfacecore傳統(tǒng)硅膠填料XTerra雜化顆粒5.不同品牌色譜柱介紹1.極寬的pH范圍(1-12)2.高溫穩(wěn)定性3.極佳的對(duì)稱峰形（含有甲基硅烷單元）4.極快的分離速度和極佳的分離度5.具有不同的鍵合相、和多種規(guī)格滿足各種不同的需求XTerra柱的優(yōu)點(diǎn)：5.不同品牌色譜柱介紹XTerraMS1.采用獨(dú)特的三點(diǎn)鍵合結(jié)構(gòu)2.適合與MS檢測器配合使用

3.封端4.PH范圍：1-125.不同品牌色譜柱介紹XTerraRP1.嵌入極性基團(tuán)2.適合與紫外、熒光、電化學(xué)以及示差折光等多種檢測器配合使用

3.有封端4.pH范圍：2-125.不同品牌色譜柱介紹2.XBridgeXBridge是XTerra的第二代雜化顆粒專利技術(shù)。XBridge骨架上具有不易水解的乙基橋存在，表現(xiàn)出對(duì)高pH溶液極好的耐受性。加上顆粒本身就具有極好的機(jī)械強(qiáng)度，使XBridge色譜柱在高pH值流動(dòng)相中具有極佳的壽命。3OH-Si(OH)4傳統(tǒng)硅膠填料5.不同品牌色譜柱介紹XBridge雜化顆粒5OH-(HO)3Si-CH2-CH2-Si(OH)3XBridge具有抗高pH進(jìn)攻的能力，另外整個(gè)骨架均勻分布，有效交聯(lián)的乙基橋式雜化顆粒表現(xiàn)出前所未有的機(jī)械強(qiáng)度和水解穩(wěn)定性。5.不同品牌色譜柱介紹XBridge柱的優(yōu)點(diǎn)：1.極寬的pH范圍(1-12)2.低pH條件下高溫（800C)仍具穩(wěn)定性3.高pH值的耐受性大大提高4.色譜柱壽命長以及對(duì)緩沖液體系表現(xiàn)出很大穩(wěn)定性5.具有不同的鍵合相、和多種規(guī)格滿足各種不同的需求5.不同品牌色譜柱介紹6.色譜柱的使用為延長色譜柱使用壽命應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：6.1樣品的前處理最好使用流動(dòng)相來溶解樣品.2.使用預(yù)柱除去樣品中強(qiáng)極性或與填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì).3.樣品要用0.45μm的過濾膜過濾.6.2流動(dòng)相的配制液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命

(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)4、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測，

還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。6.色譜柱的使用6.3流動(dòng)相流速的選擇因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。含水流動(dòng)相最好在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長。

2.流動(dòng)相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。6.4注意6.色譜柱的使用反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。

6.5.色譜柱的平衡

平衡開始時(shí)將流速緩慢地提高，用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑流速如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡）如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水“過渡”即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡；分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。6.色譜柱的使用

7.1色譜柱的再生7.色譜柱的維護(hù)

長期使用的色譜柱，往往柱效會(huì)下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）。可以對(duì)色譜柱進(jìn)行再生。再生方法：

極性固定相（如Si，NH2*

，DIOL基色譜填料）的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水（至少20倍柱體積）非極性固定相（如反相色譜填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水注意事項(xiàng)：在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

7.色譜柱的維護(hù)

7.2.

色譜柱的維護(hù)

1.使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）2.流動(dòng)相的PH應(yīng)在使用的范圍內(nèi)3.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中

4.氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。7.色譜柱的維護(hù)

在色譜分析過程中常常需要使用緩沖鹽來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，緩沖鹽的不當(dāng)使用對(duì)色譜柱可能造成柱壓升高、柱效下降以及使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化等影響：

正確使用緩沖鹽1）柱壓升高；

原因：緩沖鹽使用不當(dāng)導(dǎo)致緩沖鹽析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙，阻礙流動(dòng)相傳質(zhì)，引起柱壓升高。

2）相同化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化；

原因：如果沒有沖洗干凈就進(jìn)行進(jìn)樣，色譜柱內(nèi)含有的鹽會(huì)使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化

7.色譜柱的維護(hù)

6.色譜柱的維護(hù)

3）柱效下降；

原因：

1.有些緩沖鹽會(huì)滲入到鍵合相的深處，損害硅膠基體，導(dǎo)致色譜柱鍵合相流失，柱床變松，柱效下降；

2.凝結(jié)在鍵合相表面，使C18碳鏈難以舒展，對(duì)物質(zhì)的保留能力下降，導(dǎo)致柱效下降。因此用過緩沖鹽后需要對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗，水中緩沖鹽濃度較大時(shí)應(yīng)特別引起注意。

6.色譜柱的維護(hù)

緩沖鹽析出的補(bǔ)救方法：

1）方案1：用甲醇/水=20/80以1.0ml/min流速35攝氏度條件下反向沖洗色譜柱120min

2）方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向沖洗色譜柱過夜。1.等度條件：使用緩沖鹽前和使用后需用過渡流動(dòng)相以1.0ml/min流速?zèng)_洗60min；使用后去除緩沖鹽的另一個(gè)方法是用過渡流動(dòng)相以0.2ml/min流速?zèng)_洗色譜柱過夜。2.梯度條件：用含有緩沖鹽的流動(dòng)相跑梯度之前，用與初始流動(dòng)相組成相同的過渡流動(dòng)相以1.0ml/min流速?zèng)_洗60min，再用該過渡流動(dòng)相以1.0ml/min沖洗色譜柱120min。含緩沖鹽流動(dòng)相的梯度設(shè)定應(yīng)盡量平緩，以避免梯度過程中緩沖鹽析出。

注意：過渡流動(dòng)相是指有機(jī)相和水相的組成與分析流動(dòng)相相同，區(qū)別只是過渡流動(dòng)相不含緩沖鹽。7.HPLC故障及排除方法

7.1）保留時(shí)間變化：原因解決辦法柱溫變化柱恒溫體系沒有平衡好至少用10倍的柱體積流動(dòng)相平衡柱子緩沖液容量不夠用>25mmol/L的緩沖液柱污染沖洗柱子柱內(nèi)條件變化穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相

7.2）保留時(shí)間縮短：原因解決辦法樣品超載降低樣品量溫度增高柱恒溫流動(dòng)相組成變化防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀流速增加檢查泵，重新設(shè)定7.HPLC故障及排除方法

原因解決辦法流速下降管路泄漏、管路內(nèi)有氣泡流動(dòng)相組成變化防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀溫度降低保持柱恒溫鍵合相流失

換柱子7.3）保留時(shí)間延長：7.HPLC故障及排除方法

7.4）出現(xiàn)肩峰或分叉：原因解決辦法樣品體積過大

用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%樣品溶劑過強(qiáng)

采用較弱的樣品溶劑柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效

更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件7.HPLC故障及排除方法

原因解決辦法進(jìn)樣閥殘余峰

每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗樣品中未知物處理樣品

柱未平衡

重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑(尤其是離子對(duì)色譜)

7.5）出現(xiàn)鬼峰：7.HPLC故障及排除方法

7.6）基線噪音：原因解決辦法氣泡(尖銳峰)

流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓污染(隨機(jī)噪聲)

清洗柱,凈化樣品,用HPLC級(jí)試劑

檢測器燈連續(xù)噪聲

更換氘燈

電干擾(偶然噪聲)

采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)

檢測器中有氣泡

流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓

7.HPLC故障及排除方法

7.7）峰拖尾：原因解決辦法柱超載降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相峰干擾清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相硅羥基作用加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品7.HPLC故障及排除方法

原因解決辦法進(jìn)樣體積過大用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)檢測器時(shí)間常數(shù)過大設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%流動(dòng)相粘度過高

增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相

檢測池體積過大

用小體積池,卸下熱交換器

保留時(shí)間過長

等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫

柱外體積過大

將連接管徑和連接管長度降至最小

樣品過載

進(jìn)小濃度小體積樣品

7.8）峰展寬：7.HPLC故障及排除方法

特殊HPLC方法開發(fā)1.分析模式的選擇1.1）正相色譜屬于吸附色譜：固定相極性＞流動(dòng)相極性，固定相—極性流動(dòng)相(己烷,庚烷)-非極性,非極性物質(zhì)先出峰正相柱：多以硅膠為柱填料,根據(jù)外型可定為無定型和球型兩種，另一類正相填料是硅膠表面鍵合-CN,NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。1.2）反相色譜屬于分配色譜：固定相極性<流動(dòng)相極性，固定相—非極性流動(dòng)相(甲醇、乙腈）--極性,極性物質(zhì)先出峰樣品溶于有機(jī)溶劑溶于水溶于四氫呋喃非離子化離子化溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用硅膠的正相模式用鍵合相的正相模式用鍵合相的反相模式用鍵合相的反相模式低分子凝膠滲透色譜用鍵合相的反相模式抑制電離反相鍵合相色譜離子對(duì)鍵合相的反相模式用硅膠的正相模式離子交換模式凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜大孔填料的離子交換模式用大孔填料的反相模式分子量>2,000分子量<2,000溶于有機(jī)溶劑1.分析模式的選擇樣品分子量<2,000

流動(dòng)相調(diào)整的三原則：2.分析方法開發(fā)1）由強(qiáng)到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

（2）三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。

（3）粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。2.分析方法開發(fā)1、峰形差：1）溶劑效應(yīng)：樣品溶劑溶解能力強(qiáng)于流動(dòng)相導(dǎo)致色譜峰峰形問題--裂分峰或?qū)挿錋. 樣品溶劑

100%乙腈B. 樣品溶劑 流動(dòng)相2.分析方法開發(fā)2）中性分析時(shí)采用緩沖鹽體系含緩沖液的流動(dòng)相可改善保留,分離和色譜峰峰形。在中等pH下,離子強(qiáng)度較高,能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾。故可以增加緩沖液的溶度來減少拖尾。緩沖液 pKa pH范