中國藥典無菌檢查法課件

2005年版《中國藥典》

無菌檢查遼寧省藥品檢驗所抗生素室李冰2009.7一、2005年版無菌檢查法特點二、無菌檢查法概念三、2005年版增、修訂內(nèi)容四、供試品的無菌檢查法五、菌種

一、2005年版無菌檢查法特點完善檢查方法增加試驗的可操作性方法更具科學性，提高檢出率，保證檢驗結(jié)果的準確性縮小與先進國家藥典的無菌檢查法的差別三、增、修訂內(nèi)容

無菌檢查法的設(shè)施及環(huán)境、培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基種類及用途、培養(yǎng)基制備及裝量、培養(yǎng)基滅菌及貯藏、培養(yǎng)基的適用性檢查、試驗用菌株、最小檢驗量、方法驗證、培養(yǎng)時間、結(jié)果判斷

1、無菌檢查的設(shè)施及環(huán)境

⑴試驗環(huán)境應(yīng)在潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單項流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行、其全過程必須嚴格遵守無菌操作。

規(guī)定應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈級的檢測。

隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。

⑵隔離系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的兩方面：一是保護產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，保證無菌實驗結(jié)果的可靠性，實現(xiàn)一次檢出的要求;二是保護操作人員免受實驗過程中的有害物質(zhì)帶來的污染。

3、培養(yǎng)基的制備、裝量培養(yǎng)基可按處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度1/2。供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次。4、滅菌所有培養(yǎng)基、稀釋液及沖洗液的滅菌程序均應(yīng)驗證，方可采用。防止滅菌不徹底或過渡滅菌

5、培養(yǎng)基的貯存制備好的培養(yǎng)基應(yīng)在2-25℃、避光保存保存在非密閉容器中，應(yīng)在3周內(nèi)使用

(一般指配制的）。保存在密閉容器中，可在1年內(nèi)使用（一般指商品化的）。⑵靈敏度檢查①菌種金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)「CMCC(B)63501」生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]白色念珠菌（Candidasporogenes）[CMCC（B）98001]黑曲霉（Asperjillusniger）[CMCC（F）98003]

②菌液制備試驗菌培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間

（℃）（小時)

金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯30-3518-24

銅綠假單胞菌

枯草芽孢桿菌生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體

白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基23-2824-48

黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面5-7天

③培養(yǎng)基接種試驗菌培養(yǎng)基每管裝量接種管數(shù)接種量培養(yǎng)時間(ml)(支)（ml）（天）金黃色葡萄球菌硫乙醇酸鹽12213銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基9215黑曲霉其中硫乙醇酸鹽及改良馬丁培養(yǎng)基均有1支不接種作為空白接種量1ml含菌＜100cfu

7、稀釋液、沖洗液

0.1%蛋白胨水溶液

PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

如需要可加入表面活性劑或中和劑應(yīng)經(jīng)方法驗證證明其有效性，并對細菌存活無影響。修改原因：增加檢出率，使受損的微生物復(fù)蘇

8、方法驗證試驗

在建立供試品的無菌檢查方法時，需對供試品的抑細菌和抑真菌特性及無菌檢查方法的可靠性進行驗證

供試品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應(yīng)重新驗證，并對每一株試驗菌逐一進行驗證。（1）菌種及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度試驗方法（2）方法驗證方法培養(yǎng)基接種菌加菌量接種管數(shù)培養(yǎng)天數(shù)（cfu）（支）（天）直接接種法硫乙醇酸鹽金黃色葡萄球菌＜10023-5銅綠假單胞菌2生孢梭菌2枯草芽孢桿菌2改良馬丁白色念珠菌＜10023-5黑曲霉23-5薄膜過濾法同直接接種法

接種2管中其中1管接規(guī)定量的供試品，另1管作為對照

⑵直接接種法

取規(guī)定量培養(yǎng)基分別接入小于100cfu的試驗菌（6種菌）各2管，其中1管接入規(guī)定量供試品，另1管作為對照。培養(yǎng)3～5天。

（3）

結(jié)果判斷與對照管比較如含供試品各管中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用。按此法進行供試品的無菌檢查。

如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用。應(yīng)采取措施，消除供試品的抑菌作用。并再重新進行驗證試驗

四、供試品的無菌檢查法

無菌檢查方法包括直接接種法和薄膜過濾法。如供試品允許應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法.

3.檢驗數(shù)量指一次檢驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量除另有規(guī)定外參照表1、2、3采用薄膜過濾法應(yīng)增加1/2的最小檢驗數(shù)量作為陽性對照；采用直接接種法應(yīng)增加供試品1支（瓶）作為陽性對照。4.檢驗量指一次試驗所用供試品總量（g/ml）除另有規(guī)定外參照表2、3。若每支（瓶）供試品裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量不應(yīng)少于直接接種法的總量，只要供試品的特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾.

5.薄膜過濾法過濾器應(yīng)優(yōu)先選擇封閉式薄膜過濾也可使用一般薄膜過濾器。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)考慮供試品及其溶劑的特性，水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。⑵可溶水的固體制劑供試品取規(guī)定量，按標簽說明復(fù)溶，根據(jù)其溶解性按水溶液或非水溶性制劑項下方法操作。⑶裝有藥物的注射器供試品按水溶性制劑或非水溶性供試品項下方法操作，針頭直接接種。

（4）β-內(nèi)酰胺類抗生素供試品取規(guī)定量，按水溶性制劑或無菌粉針劑及無菌粉末原料的供試品處理法處理，薄膜過濾，用沖洗液沖洗數(shù)次。最后一次用適量的β-內(nèi)酰胺酶沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基；或?qū)V膜直接接入含適量β-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基。

（5）非水溶性的供試品取規(guī)定量，直接進行過濾或溶于含適量聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾，用0.1%～1%聚山梨酯80蛋白胨溶液沖洗濾膜至少3次，于含或不含聚山梨酯80培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

（6）可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品檢查方法

取規(guī)定量供試品加入適量不超過44℃無菌十四烷酸異丙酯內(nèi)，劇烈振搖，使供試品充分溶解，趁熱過濾（脂膜），或加入100ml稀釋液中，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后用適量的沖洗液沖濾膜數(shù)次（水膜）。十四烷酸異丙酯的配制

:

采用薄膜過濾法除菌，選用孔徑為0.22um的脂溶性濾膜，濾膜在140℃干熱滅菌2小時。

（7）無菌氣（噴）霧劑供試品取規(guī)定量，將樣品容器置冰室冷凍約1小時。速以無菌手續(xù)在容器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，按水溶性制劑或非水溶性制劑項下方法檢驗。（8）具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）取規(guī)定量，每個最小包裝用50ml～100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，集中沖洗液于適宜的無菌容器中，薄膜過濾。同時應(yīng)做包裝中所配帶的針頭的無菌檢查（直接接種法）。

6.直接接種法

供試品按規(guī)定量分別接入含培養(yǎng)細菌和真菌培養(yǎng)基的容器中，除另有規(guī)定外，每個容器中的培養(yǎng)基量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%。同時硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基每管裝量不得少于15ml、改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不得少于10ml，培養(yǎng)基用量和高度應(yīng)經(jīng)方法學驗證。①一般水溶性供試品②混懸液等非澄清水溶液供試品取規(guī)定量接種至培養(yǎng)基中。③固體制劑供試品取規(guī)定量直接接種，或加入適宜的溶劑溶解，或按標簽說明復(fù)溶后，取規(guī)定量接種至培養(yǎng)基中。④?-內(nèi)酰胺類或磺胺類供試品取規(guī)定量，混合，加入適量的無菌?-內(nèi)酰胺酶溶液或?qū)Π被郊姿崛芤菏怪泻停臃N至培養(yǎng)基中。或接入含?-內(nèi)酰胺酶或?qū)Π被郊姿岬呐囵B(yǎng)基中。⑤非水溶性供試品取規(guī)定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至培養(yǎng)基中?；蛑苯咏臃N至含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的培養(yǎng)基中。⑥敷料供試品取規(guī)定數(shù)量，以無菌操作拆開包裝，于不同部位分別剪取約100mg或1cm×3cm的供試品，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。⑦腸線、縫合線等供試品腸線、縫合線及其它一次性使用的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝，無菌拆開包裝，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。⑧滅菌醫(yī)用器具供試品取規(guī)定量，必要時應(yīng)將其拆散或切成小碎段，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。⑨放射性藥品取供試品1瓶(支)，接種于裝量為7.5ml的培養(yǎng)基中。每管接種量為0.2ml。

7.培養(yǎng)及觀察

培養(yǎng)14天，如果培養(yǎng)基渾濁或培養(yǎng)14天后從外觀不能判斷是否長菌，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種培養(yǎng)基或斜面上，培養(yǎng)細菌2天、真菌3天，觀察有無菌生長或鏡檢進行判斷。陰性對照不得有菌生長。

8.結(jié)果判斷若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定。若供試品中任何1管顯混濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

除非能充分證明，生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結(jié)果無效：

⑴對無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；⑵回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；⑶陰性對照管有菌生長。⑷供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證微生物生長是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當引起的。試驗若經(jīng)確認無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定，若有菌生長判供試品不符合規(guī)定。

表1

批產(chǎn)品出廠最少檢驗數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個）每種培養(yǎng)基最少檢驗數(shù)量注射劑

≤10010%或4個（取較多者）

100＜N≤50010個

＞5002%或20個（取較少者）大體積注射劑＞100ml

2%或10個（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品

≤2005%或2個（取較多者）

＞20010個桶裝固體原料

≤4每個容器

4＜N≤5020%或4個容器（取較大者）

＞502%或10個容器（取較大者）抗生素固體原料藥（≥5克）

6瓶(支)醫(yī)療器具

≤10010%或4件（取較大者）

100＜N≤50010件

＞5002%或20件（取較少者）

注：若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的檢驗數(shù)量應(yīng)加倍

表2.上市抽驗樣品（液體制劑）的最少檢驗量供試品裝量V(ml)每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少量（ml）最少檢驗數(shù)量（瓶或支）≤1全量

20①1＜V＜5半量105≤V＜2021020≤V＜5051050≤V＜100101050≤V＜100(靜脈給藥)半量10100≤V≤500半量6V＞50050061.每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。

表3上市抽驗樣品（固體制劑）的最少檢驗量供試品裝量M（/支、瓶或個）每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少量（mg）最少檢驗數(shù)量（瓶或支）M<50mg全量

20①50mg≤M<300

mg半量10300

mg≤M<5g150

mg10M≥5g500

mg

10②外科用敷料棉花及紗布取100mg或1cm×3cm10縫合線、一次性醫(yī)用材料整個材料③

20①帶導(dǎo)管的一次性醫(yī)療器具（如輸液袋）

10其它醫(yī)療器具整個器具③（切碎或拆散開）

20①注：①.每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。

②.抗生素粉針劑（≥5克）及抗生素原料藥（≥5克）的最少檢驗數(shù)量為6瓶（或支），桶裝固體原料的最少檢驗數(shù)量為4個包裝。③.如果醫(yī)用器械體積過大，培養(yǎng)基用量可在2000ml以上，將其完全浸沒。五、菌種驗證試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），以保證試驗菌株的生物學特性。應(yīng)采用適宜的保存技術(shù)，防止試驗菌株發(fā)生變異。

菌種的保存

對微生物實驗來說菌種是特殊的標準品應(yīng)給予相同于化學標準品的管理（溯源性、質(zhì)量的原始性）外，還有安全性方面的管理。1.

溯源性(菌種的來源)：藥品微生物實驗室的標準菌種應(yīng)來自中國藥品生物檢定所醫(yī)學菌種保藏中心（ChinaMedicalCultureCollection——CMCC）系列?；蛎绹幍涫蛰d的美國菌種保藏中心（AmericanTypeCultureCollection——ATCC）系列等國際法定菌種保藏中心。2.菌種的質(zhì)量控制：對選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)的典型菌落進行鑒定。形態(tài)、染色鏡檢、純度、必要時應(yīng)做生化鑒定試驗，一旦出現(xiàn)偏差，應(yīng)做進一步的調(diào)查，所有被確認受到污染或變異的菌種應(yīng)及時銷毀，不得用于常規(guī)實驗用。

3.菌種管的標簽要求—名稱、編號、代數(shù)、有效期、制備日期

菌種記錄：名稱、編號、來源、菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化與血清學鑒定、傳代數(shù)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件、保藏方法、貯存條件及保藏庫址。4.菌種保藏方法有多種，但對不同的微生物應(yīng)通過保藏試驗來選擇最適宜保藏方法。一般多用瓊脂斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、干燥沙土保藏方法、冷凍真空保藏法、甘油冷凍管保藏法等。⑴瓊脂斜面低溫保藏方法實驗室多采用此法一般在4℃保存。銅綠假單孢菌在室溫保存。

⑵液體石蠟保藏法本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理、生化水平，延長菌種保藏時間。

方法：液體石蠟121℃高壓滅菌30min或110-170℃烘箱1-2h干燥去掉水分。

取經(jīng)培養(yǎng)的高層半固體菌管加入石蠟，高出培養(yǎng)基面1cm為宜，在4℃保藏。

⑶冷凍真空保藏法保護劑有多種，多用脫脂牛奶。將牛奶煮沸、靜止、冷卻除去上面一層脂肪，重復(fù)3次用脫脂棉過濾，113℃高壓滅菌30min，接入菌種，培養(yǎng)后低溫、冷凍、真空干燥置-35℃保存。（4）甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間后（細菌24～48小時的培養(yǎng)物，白色念珠菌72小時的培養(yǎng)物。），用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細菌充分擴散到預(yù)先裝于試管中的無菌蒸餾水中，調(diào)整菌液濃度，向已制備好的菌懸液中加入等體積20％的無菌甘油，輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混和，分裝于無菌小管，制好的甘油冷凍管最好在－30℃貯存。5、微生物廢棄物的滅活

廢棄的菌種、菌液、帶菌培養(yǎng)基以及帶菌器皿須經(jīng)過高壓（121℃）滅菌后方可處理。無菌室管理制度1無菌室的要求1.1無菌室是專門進行藥品無菌、微生物限度檢查的試驗室，不得進行其他試驗，無菌檢查用無菌室與微生物限度檢查用無菌室應(yīng)各自獨立。1.2無菌室由更衣室、緩沖室及操作間組成。1.3無菌室設(shè)連鎖式傳遞窗口，以保證人流物流分開。1.4操作間應(yīng)達到潔凈度10，000級，內(nèi)設(shè)無菌凈化臺，潔凈度達到100級。1.5第二更衣室設(shè)有洗手盆。1.6各房間設(shè)有照明燈，紫外燈。電源開關(guān)應(yīng)設(shè)在室外。1.7無菌室應(yīng)有空氣凈化除菌的層流系統(tǒng)，保證試驗時空氣正壓。1.8無菌試驗時無菌室的溫度應(yīng)控制在18～26℃范圍內(nèi)，相對濕度應(yīng)控制在60%以下。2無菌室的管理2.1無菌室由專人管理2.2無菌室應(yīng)每半年檢測一次室內(nèi)的潔凈度（塵埃粒子計數(shù)儀）并應(yīng)符合要求，同時做好記錄。每一個月檢測一次室內(nèi)的無菌度（平板計數(shù)法），應(yīng)符合要求，同時做好記錄。2.3無菌室內(nèi)僅存放最必須的檢驗用具，保持固定位置，不隨意移動。3無菌室的使用3.1每次試驗前應(yīng)用消毒劑擦拭工作臺面及可能污染的死角，開動空氣凈化系統(tǒng)及紫外燈殺菌20～30分鐘。3.2人員進入無菌室須經(jīng)更衣并洗手后方可進入無菌室。3.3檢驗樣品及培養(yǎng)基等試驗物品進入試驗室必須通過傳遞窗，并在傳遞窗內(nèi)經(jīng)紫外燈照射20～30分鐘。在操作間內(nèi)除去物品的外包裝后進行試驗。3.4根據(jù)檢測的情況決定是否用丙二醇進行空氣消毒，及更換濾器。3.5每次試驗后同樣須用消毒劑擦拭工作臺面，及可能污染的死角，打掃干凈臺面、地面后繼續(xù)開動空氣凈化系統(tǒng)以除去室內(nèi)的濕