清華大學(xué)微生物學(xué)第六章 生長繁殖及控制2

第三節(jié)影響微生物生長的主要因素三、PH值一、溫度

二、氧氣一、溫度一、溫度生長溫度三基點最適生長溫度：某菌代時最短或生長速率最高時的培養(yǎng)溫度。最適生長溫度并非一切生理過程的最適溫度一、溫度二、氧氣微生物與氧的關(guān)系二、氧氣為什么厭氧菌遠(yuǎn)離氧氣呢？好氧微生物可以通過呼吸產(chǎn)生能量，滿足機(jī)體的需要，但氧會使一切生物產(chǎn)生有毒害作用的代謝產(chǎn)物，如超氧陰離子自由基與H2O2超氧陰離子自由基的特點？帶負(fù)電，兼有分子、離子性質(zhì)性質(zhì)及不穩(wěn)定，化學(xué)反應(yīng)能力極強(qiáng)可破壞細(xì)胞內(nèi)各種大分子和膜結(jié)構(gòu)或形成其他活性氧化物超氧陰離子自由基的特點？為什么只有厭氧菌害怕氧氣呢？三、PH

微生物生長過程中機(jī)體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)的反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)都有一個最適pH范圍，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長速率最大因此微生物生長也有一個最適生長的pH范圍。三、PH三、PH三、PH1.微生物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的PH是否穩(wěn)定？2.微生物的生命活動會改變培養(yǎng)基或外環(huán)境的PH嗎？三、PH2.微生物的生命活動會改變培養(yǎng)基或外環(huán)境的PH嗎？三、PH如何在發(fā)酵過程中及時調(diào)節(jié)pH？第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論良好微生物培養(yǎng)裝置的條件：

應(yīng)在提供豐富而均勻的營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，能保證微生物獲得適宜的溫度和對絕大多數(shù)微生物所必需的良好通氣條件（只有少數(shù)厭氧菌例外），此外，還要為微生物提供一個適宜的物理化學(xué)條件和嚴(yán)防雜菌的污染等。

第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展：①從少量培養(yǎng)發(fā)展到大規(guī)模培養(yǎng)；②從淺層培養(yǎng)發(fā)展到厚層（固體）或深層（液體）培養(yǎng)；③從以固體培養(yǎng)技術(shù)為主發(fā)展到以液體培養(yǎng)技術(shù)為主；④從靜止式液體培養(yǎng)發(fā)展到通氣攪拌式的液體培養(yǎng)；⑤從單批培養(yǎng)發(fā)展到連續(xù)培養(yǎng)以至多級連續(xù)培養(yǎng)；⑥從利用分散的微生物細(xì)胞發(fā)展到利用固定化的細(xì)胞集團(tuán)；⑦從單純利用微生物細(xì)胞到大量培養(yǎng)、利用高等動、植物細(xì)胞；⑧從單菌發(fā)酵發(fā)展到混菌發(fā)酵；⑨從利用野生菌種發(fā)展到利用變異株以及“工程菌”；⑩低密度培養(yǎng)到高密度培養(yǎng)等等。

第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論一、實驗室培養(yǎng)法二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論一、實驗室培養(yǎng)法（一）固體培養(yǎng)法（二）液體培養(yǎng)法一、實驗室培養(yǎng)法高層瓊脂柱厭氧培養(yǎng)皿亨蓋特滾管技術(shù)厭氧罐厭氧手套箱固體培養(yǎng)法斜面、平板、克氏扁瓶、茄子瓶厭氧菌培養(yǎng)好氧菌培養(yǎng)一、實驗室培養(yǎng)法克氏扁瓶茄子瓶一、實驗室培養(yǎng)法（1）高層瓊脂柱

用加有還原劑的固體或半固體培養(yǎng)基裝入試管中，以培養(yǎng)相應(yīng)的厭氧菌。在這種培養(yǎng)基中，越是深層，其氧化還原勢越低，因而越有利于厭氧菌的生長。

（2）厭氧培養(yǎng)皿利用皿蓋去創(chuàng)造一個狹窄空間，加上使用還原性培養(yǎng)基而達(dá)到無氧培養(yǎng)的目的（例如Brewer皿，見圖6-10）；利用皿底有兩個相互隔開的空間，其中之一放焦性沒食子酸，另一則放NaOH溶液，在皿蓋平板上接入待培養(yǎng)的厭氧菌后，立即密閉。經(jīng)搖動，使焦性沒食子酸與NaOH溶液接觸，發(fā)生吸氧反應(yīng)，從而造成無氧環(huán)境（如SPray皿或Bray皿一、實驗室培養(yǎng)法

（3）亨蓋特滾管技術(shù)原理：利用除氧銅柱來制備高純氮，并用高純氮驅(qū)除小環(huán)境中的空氣，使培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌和貯存，以及菌種的接種、培養(yǎng)、觀察、分離、移種和保藏等過程始終處于高度無氧條件下，從而保證了這類嚴(yán)格厭氧菌的存活。一、實驗室培養(yǎng)法

優(yōu)點：試管內(nèi)壁有較大的表面積試管口面積、試管腔體積極小有利于阻止氧與厭氧菌的接觸一、實驗室培養(yǎng)法（4）厭氧罐技術(shù)一、實驗室培養(yǎng)法（4）厭氧罐技術(shù)這是一種常規(guī)的不很嚴(yán)格的厭氧技術(shù)，可用于培養(yǎng)多數(shù)厭氧菌。在罐內(nèi)一般可放10個常用的培養(yǎng)皿（直徑9cm）或任何液體培養(yǎng)的試管。使用時，先裝入待培養(yǎng)的對象，然后密閉罐蓋，接著可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合氣（N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V）。這樣，罐內(nèi)少量剩余氧在鈀催化劑作用下，可被灌入的混合氣中的H2還原成水，從而造成很高的無氧狀態(tài)。這時指示劑美藍(lán)被還原成無色。一、實驗室培養(yǎng)法（4）厭氧罐技術(shù)目前，國際上盛行方便的“GasPak”產(chǎn)氣袋商品，把袋口剪開一角并加適量水后，即會自動放出足夠的CO2和H2。這就是內(nèi)源式的氫氣和二氧化碳源。一、實驗室培養(yǎng)法（4）厭氧罐技術(shù)特點：厭氧菌培養(yǎng)過程處于無氧狀態(tài)培養(yǎng)基配制、接種、觀察分離、保藏等過程無法保證一、實驗室培養(yǎng)法（5）厭氧手套箱實驗室研究厭氧菌的三大重要技術(shù):厭氧手套箱技術(shù)厭氧罐技術(shù)亨蓋特滾管技術(shù)一、實驗室培養(yǎng)法淺層液體靜止培養(yǎng)搖瓶振蕩培養(yǎng)通入加壓空氣機(jī)械攪拌等——液體培養(yǎng)法好氧菌的液體培養(yǎng)如何提高氧的供應(yīng)？一、實驗室培養(yǎng)法——液體培養(yǎng)法實驗室常用好氧菌培養(yǎng)法：試管液體培養(yǎng)三角瓶淺層液體培養(yǎng)搖瓶振蕩培養(yǎng)臺式發(fā)酵罐一、實驗室培養(yǎng)法搖瓶振蕩培養(yǎng)：

即將三角瓶內(nèi)培養(yǎng)液用8層紗布包住瓶口，以取代一般的棉花塞，同時降低瓶內(nèi)的裝液量，把它放到往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床上作有節(jié)奏的振蕩，以達(dá)到提高溶氧量的目的。此法是荷蘭的A．J．Kluyver等于1933年最早試用，目前仍廣泛地用于菌種的篩選以及進(jìn)行生理、生化和發(fā)酵等試驗中。一、實驗室培養(yǎng)法（4）臺式發(fā)酵罐體積一般為幾升至幾十升，并有多種自動控制和記錄裝置?，F(xiàn)成的商品種類很多，用作發(fā)酵研究十分方便。平行發(fā)酵罐

第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置（一）固態(tài)培養(yǎng)法好氧菌的曲法培養(yǎng)2.厭氧菌的堆積培養(yǎng)法二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置（一）固態(tài)培養(yǎng)法好氧菌的曲法培養(yǎng)好氧菌的固體培養(yǎng)方法都是將接過種的固體基質(zhì)薄薄地攤鋪在容器表面，這樣，既可使微生物獲得充分的氧氣，又可讓微生物在生長過程中產(chǎn)生的熱量及時釋放，這就是曲法培養(yǎng)的基本原理。第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置（一）固態(tài)培養(yǎng)法第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置（一）固態(tài)培養(yǎng)法根據(jù)制曲的容器形狀和規(guī)模的大小，可把各種制曲方法分成瓶曲、袋曲（用塑料袋制曲）、盤曲（用木盤制曲）簾子曲（用竹簾子制曲）、轉(zhuǎn)鼓曲（用木質(zhì)空心轉(zhuǎn)鼓，不斷轉(zhuǎn)動制曲）和通風(fēng)曲等。第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置（一）固態(tài)培養(yǎng)法第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論（一）固態(tài)培養(yǎng)法2.厭氧菌的堆積培養(yǎng)法第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論（一）固態(tài)培養(yǎng)法2.厭氧菌的堆積培養(yǎng)法二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置（二）液體培養(yǎng)法——好氧菌的培養(yǎng)（1）淺盤培養(yǎng)（2）深層液體通氣培養(yǎng)發(fā)酵罐二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置發(fā)酵罐（fermenter）是一種鋼質(zhì)圓筒形直立容器，有扁球形的底和蓋，其高與直徑之比一般為1∶2～2.5。容積可大可小，大型發(fā)酵罐的容積在50～500m3間，最大的為英國用于甲醇蛋白生產(chǎn)的巨型發(fā)酵罐，其有效容積達(dá)1500m3。二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置發(fā)酵罐啤酒發(fā)酵罐大型發(fā)酵罐（二）液體培養(yǎng)法二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置厭氧菌大規(guī)模的液體培養(yǎng)裝置迄今為止，能作大規(guī)模液體培養(yǎng)的厭氧菌僅局限于丙酮丁醇梭菌的丙酮丁醇發(fā)酵一種。由于該菌是嚴(yán)格厭氧菌，故可省略通氣、攪拌設(shè)備，簡化工藝過程，還能大大節(jié)約能源的消耗。由于厭氧發(fā)酵罐不必安裝通氣、攪拌裝置，所以其體積一般可明顯大于有通氣、攪拌設(shè)備的發(fā)酵罐（國際上厭氧發(fā)酵罐的體積可達(dá)到2000m3），從而提高了生產(chǎn)效率。第五節(jié)有害微生物的控制第五節(jié)有害微生物的控制滅菌：采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施。第五節(jié)有害微生物的控制消毒：是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。例如一些常用的對皮膚、水果、飲用水進(jìn)行藥劑消毒的方法；對啤酒、牛奶、果汁和醬油等進(jìn)行消毒處理的巴氏消毒法，等（二）消毒（disinfection）第五節(jié)有害微生物的控制（三）防腐（antisepsis）防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。第五節(jié)有害微生物的控制防腐的措施很多，主要有：（1）低溫利用4℃以下的各種低溫

（2）缺氧在密閉容器中加入除氧劑（3）干燥曬干或紅外線干燥等（4）高滲鹽腌和糖漬等（5）高酸度泡菜（6）防腐劑苯甲酸、尼泊金、山梨酸等第五節(jié)有害微生物的控制（四）化療（chemotherapy）化療即化學(xué)治療。它是利用具有高度選擇毒力（selectivetoxicity，即對病原菌具有高度毒力而對宿主無顯著毒性）的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。二、物理滅菌因素的代表——高溫高溫的致死作用，主要是由于它使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物高分子發(fā)生變性、破壞，例如它可使核酸發(fā)生脫氨、脫嘌呤或降解，以及破壞細(xì)胞膜上的類脂質(zhì)成分等。（一）高溫殺菌作用的種類二、物理滅菌因素的代表——高溫1、干熱滅菌法火焰灼燒（最徹底）烘箱內(nèi)熱空氣滅菌干熱滅菌溫度：150-170℃時間：1-2h對象：金屬器械、玻璃器皿等1、干熱滅菌法細(xì)菌的芽孢是耐熱性最強(qiáng)的生命形式，所以，干熱滅菌時間常以幾種有代表性的細(xì)菌芽孢的耐熱性作參考標(biāo)準(zhǔn)

2、濕熱滅菌相同溫度和作用時間下，濕熱比干熱滅菌更好？更易于傳遞熱量；更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)濕熱對一般營養(yǎng)體和孢子的殺滅條件：多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞：在60℃左右處理5-10分鐘；酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上溫度處理；細(xì)菌的芽孢：121℃處理15分鐘以上；2、濕熱滅菌2、濕熱滅菌對象：牛奶、啤酒、果酒或醬油等For:高溫會破壞食品的營養(yǎng)與風(fēng)味巴氏消毒法具體方法低溫維持法：只要在63℃下維持30min高溫瞬時法：只要在72~85℃下維持15s超高溫法：只要120~140℃加熱2~4秒

煮沸消毒

一般用于飲用水的消毒（100℃下數(shù)分鐘）。

對于某些培養(yǎng)基，由于高壓蒸汽滅菌會破壞某些營養(yǎng)成分，可用間隙滅菌法滅菌，即流通蒸汽(或蒸煮)反復(fù)滅菌幾次，間隙滅菌法第一次蒸煮后殺死微生物營養(yǎng)體，冷卻，培養(yǎng)過夜，芽孢萌發(fā)，又第二次蒸煮，殺死營養(yǎng)體。這樣反復(fù)2—3次就可以完全殺死營養(yǎng)體和芽孢，也可保持某些營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞。常規(guī)加壓蒸氣滅菌法2.濕熱滅菌法——（2）加壓法連續(xù)加壓蒸氣滅菌法2.濕熱滅菌法——加壓法將待滅菌的物件放置在盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋（或家用壓力鍋）內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉。再繼續(xù)加熱就會使鍋內(nèi)的蒸氣壓逐漸上升，從而溫度也上升到100℃以上。2.濕熱滅菌法——加壓法為達(dá)到良好的滅菌效果，一般要求溫度應(yīng)達(dá)到121℃（壓力為1kg／cm2或15磅／英寸2），時間維持15～20分鐘，也可采用在較低的溫度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下維持35分鐘的方法。2.濕熱滅菌法——加壓法此法適合于一切微生物學(xué)實驗室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌。連續(xù)加壓蒸氣滅菌法2.濕熱滅菌法——加壓法135~140℃下維持5~15s優(yōu)點：提高原料利用率、產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量

提高發(fā)酵罐利用率提高鍋爐利用率

宜于自動化操作適用范圍：大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用

2.濕熱滅菌法——加壓法利用溫度進(jìn)行殺