顯微熒光檢測及鈣成像技術

-熒光的基礎知1、熒熒光是冷光，顏色為熒光是冷光，顏色為藍、綠、紅和 熒光的發(fā)光原2、熒光的發(fā)光原 由光激發(fā)引起的熒光由光激發(fā)引起的熒光—由化學反應引起的熒光—由X射線引起的熒光—X由激光引起的熒光—化學熒光在有生命的生物體中產(chǎn)生— 熒光色素的性1、激發(fā)光波長和發(fā)射光

2、激發(fā)光譜和發(fā)射激發(fā)光譜（吸收光譜）：激發(fā)光譜（吸收光譜）：通過測量熒光物質的熒光發(fā)射強度隨激發(fā)2、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的熒光強度。在λex兩側激發(fā)波長范圍λ1－λ2所對應的是強發(fā)射熒光區(qū)域，即3、熒光穩(wěn)定4、組織細胞的自發(fā)常用的熒光探 熒光探針的類

熒光成像的應

1、鈣離子有機熒光2、以蛋白為基礎的鈣離子熒光探鈣生物傳感器：Cameleon（enhancedcyan-fluorescentproteinorECFPyellow-fluorescentproteinorYFP）Calciumgreen‐dextran顯微注射進入百合花粉原生，研究CaM和CaM‐conjugatedquantumdot(QD)對胞內(nèi)鈣離子濃度的影響（WangQ,etal.JBiolChem.,284(18):12000‐7） 其他金屬離子的熒光探1、Mg2+MagnesiumGreenIndicator（可見光激發(fā)

J.Am.Soc.,2006,1281、Zn2+例如：FluoZinChimActa.2014,826:pHpH1、熒光素及衍生比。在生理pH范圍內(nèi)（pH6.4－pH7.4），BCECF的比例熒光與pH2、半萘酚羅丹熒激發(fā)激發(fā)光譜為pHpH值，也可用其某一波 （JolanaT.PAlbrechtová,etPlantPhysiologyandBiochemistry, 細胞器熒光探線粒體熒光探針——Mito ，JC-1，Rhodamine溶酶體熒光探針——LysoTracker?&Lyso ，DAMP，Neutral內(nèi)質網(wǎng)熒光探針——ERTracker ，NBDCeramide,BODIPY 細胞骨架熒光探G-肌動蛋白熒光探針——熒光標記的DNase微管選擇性紫杉醇探針——BODIPYFL （HeLacellswerestainedwithCF555phalloidin(red),mouseanti‐α‐tubulinfollowedbygoatanti‐mouseCF488AIgG(green)andDAPI(blue),respectively.）胞膜透過性核酸熒光探針（用于細胞染色非透過性核酸熒光探針（用于DNA瓊脂凝膠電泳PremoTMgeminin–GFPG2/MPremoTMCdt1–RFPG1/S 氧化應激檢測：CellROX?試色Deep是可不是不是可可第三部熒光成像中的常見問題和解 熒光的淬滅和抗淬1、熒光的淬 熒光的淬滅和抗淬2、熒光的抗淬 熒光的淬滅和抗淬AlexaFluor488VSfluorescein 熒光的淬滅和抗淬TheAlexa 熒光的非特異性結2、固定細胞成像中熒 與細胞組分的非特異性結封閉液或BSA不起作用。使用Image－IT?FXSignalEnhancer抑制熒光帶來的非特異性背景3、消除活細胞成像中的背景第四部顯微熒光檢測技 熒光成像種1、熒光染用對組織切片進行處理，使組織中的不同成分被

2、免疫

免疫熒 免疫酶組織化Ab2

卵白素

Ab-

生物素化

生物素ABC復合IF：1Ab+2Ab-fluorescencedye3、熒光蛋白表GFPpositivemotorneuronewithadultzebrafish.

35s(plasma

35sH2B: 技術種 技術比 Time-lapse動態(tài)成 分辨率成像技術對術20-10-區(qū)域使用較強激光，可使用有機，生物樣易做活細胞測的定位為力

第五部激光共聚焦顯微鏡及圖ZeissZeissLSM710 共聚焦原共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的

0.20.250.180.240x40x/1,340x/1,3

40x/1,340x/1,3

WideWide（加黑的虛折線）正對，另一個（淺色虛折 圖像掃描方Max.Scanned

圖像掃描策1、掃描速Speed：控制成像速度，速度越慢，到的信號 Framespersecond：會影響時間分辨率2、Z- Z-d物鏡數(shù)值孔徑共聚焦針孔的直徑光的波長介質折射率

d=Pn/CCD3、信噪1降低掃描速度：控制成像速度。速越慢，增加圖像上每個象素點的停留 4、掃描方FlyBackBlanking,Zoom FlyBackBlanking,Zoom FlyBackBlanking,ZoomRotation

FlyBackBlanking,ZoomRotation45°,X,YBi‐directionalScan,Zoom Bi‐directionalScan,ZoomRotation

FastestFastestswitchingbetweentracks‐SwitchTrackeveryLine+雙通道往返掃描，速度最5、光譜交叉問題（cross Alexa488andAlexa

488

561 Alexa488

Alexa488Alexa488Alexa546detection

AlexaAlexaAlexaAlexa在用Alexa488和Alexa546標記生物樣品時，我們同時用488和561激發(fā)掃描，AlexaAlexa488Alexa488 detection

AlexaAlexa

+ 疊+ Bestcompromise：為6、如何拍出一張好 灰度值256 0DigitalGain：信號電子放大，增大則信號和噪音都增強，減小則信號和GainDigitalDigitalOffsetatDigitalOffsetatLossofdynamicDigitalOffsetat丟失信DigitalDigitalDigital0Digital1Digital0Digital第六部實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變實時定量測定細胞內(nèi)Ca實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+1、細胞的鈣轉移 實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變2、顯微熒光測鈣的fura-2僅5ms，而微電極測量需要幾秒，NMR法則需 實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+3、鈣熒光探針分

定量探（雙波長指示劑非定量探（單波長指示劑

Indo1，F(xiàn)uraFluo3/Flou4、Fura2,IndoFluo3/Fluo4、CalciumGreen、CalciumOrange 實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變4、鈣熒光探針的鈣探針的化學結構：酸化、酯化、葡萄糖 的作用下水解,恢復為不能通過細胞膜的游離酸形式,進而與細胞內(nèi)鈣結合檢測目實時定量測定細胞內(nèi)Ca實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+根據(jù)解離常數(shù)（Kd）選擇合適的探度范圍是(0.1～10)×Kd。但其敏感的范圍卻是接近或略低于Kd。實時定量測定細胞內(nèi)Ca實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+5、影響顯微熒光測鈣的細胞內(nèi)緩鈣熒光探針可作為細胞內(nèi)鈣的緩沖劑，探針的Kd高,達到飽和的負載量越高,對細胞內(nèi)鈣的緩沖作用也越強,可能使測定的鈣代表有Fura2、CalciumGreen1、FuraRed 實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變區(qū)域 轉運抑制劑(如丙磺舒、苯磺唑酮)等 實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變滲 ,例如鈣綠由于比Fura2多一個正電荷,其滲漏現(xiàn)選擇抗?jié)B漏 ,如FuraPE3、IndoPE3、FluoLR等 實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變6、雙波長指示它的數(shù)據(jù)形式采取比例的方式,不受實驗設備、光路組成、 光(340nm)激發(fā)產(chǎn)生FURA-2

1、激發(fā)波長380nm（Fura2）和340（鈣離子-Fura2），發(fā)射波長5102、340nm380nm 實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變6、單波長指示 但其數(shù)據(jù)直接為熒光強度值,易 Indo-1具有單波長激發(fā),雙波長發(fā)射nm無鈣時的475nm變?yōu)殁}飽