臨床微生物實驗室規(guī)范化管理介紹

全國基層醫(yī)療機構(gòu)

抗菌藥物合理應用培訓項目臨床微生物試驗室

規(guī)范化管理天津市第一中心醫(yī)院張堅磊臨床微生物學所面臨的挑戰(zhàn)

（一）新傳染病的不斷出現(xiàn)

使臨床對感染性疾病的診斷和治療陷入了逆境（二）多重耐藥細菌的出現(xiàn)隨著抗生素的廣泛應用，我國已經(jīng)提早步入抗生素高水平耐藥的國家行列，某些菌株的耐藥性甚至位居全球之首剛好、精確的病原菌診斷—正確的形態(tài)學分析與病原鑒定，具備疑難病原確認技術(shù)細菌耐藥性監(jiān)控—標準的抗藥性檢測與結(jié)果說明醫(yī)院感染的監(jiān)控—能快速反應醫(yī)院感染與應急事務必需規(guī)范臨床微生物試驗室的管理臨床微生物室所面臨的任務國際上試驗室的規(guī)范化標準美國國會的臨床試驗室改進法案修正案1988（簡稱CLIA88）法國政府也于1999年11月發(fā)布了NOR：MESP9923609A《關(guān)于正的確施醫(yī)學生物分析試驗的決議》。

ISO15189《醫(yī)學試驗室——質(zhì)量和實力的具體要求》衛(wèi)生部于2006年6月1日頒布

《醫(yī)療機構(gòu)臨床試驗室管理方法》

2008年31家醫(yī)院試驗室通過認可

ISO15189《醫(yī)學試驗室—質(zhì)量和實力的專用要求》

我國試驗室規(guī)范化管理進程臨床試驗室管理方法第一章總則（5條）其次章試驗室管理的一般規(guī)定（16條）第三章試驗室質(zhì)量管理（11條）第四章試驗室平安管理（11條）第五章監(jiān)督管理（9條）第六章附則（4條）5.技術(shù)要求5.1人員5.2設施和環(huán)境條件設施5.3試驗室的設備5.4檢驗前程序5.5檢驗程序5.6檢驗程序的質(zhì)量保證5.7檢驗后程序5.8結(jié)果報告ISO15189《醫(yī)學試驗室——質(zhì)量和實力的專用要求》ISO15189認可與微生物試驗室ISO15189—醫(yī)學試驗室質(zhì)量和實力的專用要求依據(jù)其質(zhì)量管理體系要求，改進檢驗流程、規(guī)范試驗操作、提高檢測實力，使每項微生物檢驗技術(shù)與診斷報告可追溯到體系的源頭，為客戶供應精確、快速、平安、經(jīng)濟的微生物專業(yè)診斷服務.既從病人準備、標本采集、標本傳遞與方法選擇，到診斷報告得出、結(jié)果說明與指導臨床的標準化過程.

參考CLSI文件從以下

7方面提出建議標本采集和運輸?shù)幕疽?guī)范；培育前標本質(zhì)量檢測基本規(guī)范標本分別的基本規(guī)范細菌鑒定基本規(guī)范；細菌藥物敏感試驗基本規(guī)范；試驗室質(zhì)量保證基本規(guī)范；細菌報告基本規(guī)范；

一.標本采集和運輸標本采集和運輸是細菌培育成功的最最重要的關(guān)鍵微生物人員和臨床醫(yī)護人員一道，依據(jù)臨床微生物檢驗規(guī)范的規(guī)定，研討和制定本院微生物標本采集、保存和運輸?shù)木唧w要求。要廣泛宣揚，細致實施，建立健全標本驗收制度，對于不合格的標本要堅決退回，說明緣由，要求重送。美國與歐洲對試驗室的新要求NCCLSM40標準DIN58942標準1.痰標本的采集和運輸1.標本采集時間：用抗生素前2.采集方法：自然咳痰：必需用請水漱口3次，應包括咽喉部，立刻用力咳出痰，于滅菌容器中或輸送培育基中。支氣管鏡或支氣管毛刷:由醫(yī)生采集，建議干脆種入輸送培育基2.泌尿標本的采集和運輸1．采集后的標本應立刻送檢。2．采集時間：多數(shù)藥物從尿道排泄，所以不管用哪種方法都應在用藥前采集。應采集早晨第一次的尿。3標本管不應含防腐劑和消毒劑。4.長期留置導尿管的患者應在更換新管時留取尿標本。5.做厭氧培育時應膀胱穿刺采集尿。3.分泌物的采集和運輸1.對開放性病灶的采集：如眼結(jié)膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術(shù)后切口、導管治療感染、瘺管內(nèi)膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的組織送檢。2.閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉的膿腫常接受穿刺或引流的的方法采樣，應在用藥前采集，應留意膿液的氣味、性狀、顏色留意厭氧菌存在的可能。不能剛好送檢應應用輸送培育基。4.便標本的采集和運輸1.采集時間：腹瀉患者應在用藥前、急性期采集；沙門菌感染、腸熱癥應在2周內(nèi)采；厭氧菌出現(xiàn)癥狀即采集。2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有膿血和黏液的部位的糞便2-3克，如液狀糞便取絮狀物盛于無菌的、密封的、不吸水的、容器內(nèi)或干脆盛于增菌液或保存液中；對不易獲得糞便患者及幼兒，可用直腸拭子采集后置保存液或輸送培育基中送檢。便標本的采集和運輸

留意事項：⑴雖然糞便標本本身含很多細菌但也要用無菌容器。⑵在患者病情許可的條件下應在用藥前采集標本。⑶應床邊接種或置輸送培育基送檢。⑷厭氧細菌（難辯梭菌）培育的標本應盡量削減與空氣接觸。5.厭培育標本的采集和運輸1.痰標本的厭氧培育標本采集：必需用氣管穿刺法獲得痰液，從口腔吐出的痰標本不能用于厭氧培育。2.尿標本的厭氧培育標本采集：恥骨上膀胱穿刺獲得尿標本可用于厭氧菌培育3．便標本厭氧培育標本采集：可用排出的便做厭氧培育但也應少與空氣接觸。6.血液及骨髓標本的采集和運輸1.

采血時間：盡可能在用抗生素前，心內(nèi)膜炎例外。2.采血量：至少應采一套2瓶，分需氧和厭氧。血量按培育瓶要求，先將1注入需氧瓶，再將剩余血注入?yún)捬跗俊?.采血方法：不要與血氣和血沉標本一起采血；不舉薦血入瓶前換針頭；不舉薦靜脈血干脆入瓶；不宜在靜脈導管或靜脈留置口采血。血液及骨髓標本的采集和運輸4.

采血間隔：如第一次采集2套（4瓶）血培育標本，在以后的2-5天不必采血，但除外心內(nèi)膜炎和導管相關(guān)性敗血癥。5.

兒童：采血量是總血量的1%。6.

延遲培育瓶處理:延遲培育瓶不要放冰箱或孵箱，放常溫，盡早送往臨床細菌室。7.

皮膚消毒液舉薦：建議先用70-80%異丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。二.標本培育前的基本規(guī)范1.痰培育標本試驗室在接種前必需作痰涂片革蘭染色，當在低倍鏡下白細胞<10個/LP、上皮細胞>25個/LP時應作為不宜做培育的標本；當白細胞<10個/LP，上皮細胞<25個/LP時再參照油鏡視察標本中細菌分布作出推斷。痰培育標本當標本中細菌種類超過3種以上，未見到纖毛狀柱上皮細胞，作為不合格標本；如見到數(shù)量不等的白細胞或纖毛柱狀上皮細胞或兩者同在，含1-2種不同細菌，可考慮接著培育，結(jié)果可依據(jù)病情再作分析；當涂片中見到1-3種細菌，少量的扁平上皮細胞，少量或較多釬毛拄狀上皮細胞均可按合格標本接著培育。2.厭氧培育在正常上班時間：申請厭氧培育的科室應邀請試驗室，由臨床醫(yī)生或護士協(xié)作采集，細菌室行床邊接種。自然排出的尿標本、用棉拭子采集的分泌物、自然咳出的痰標本均為不合格的厭氧培育的標本，應于退檢。沒有條件或不能剛好送檢的狀況下均應用輸送培育基放置標本。3.培育前應有涂片結(jié)果

結(jié)合涂片推斷定植菌或致病菌⑴尿培育分別出3種以上的細菌，或分別出凝固酶陰性葡萄球菌、革蘭陽性棒狀桿菌等非定義為致病菌的細菌，涂片未見到，應在報告中提示可能是污染細菌建議結(jié)合臨床表現(xiàn)考慮結(jié)果的參考價值。⑵眼結(jié)膜拭子分別出凝固酶陰性葡萄球菌，涂片未見到，可能是污染細菌，應建議重送標本。培育結(jié)果結(jié)合涂片推斷定

植菌或致病菌⑶前列腺液標本分別出凝固酶陰性葡萄球菌或革蘭陽性小桿菌，涂片未見到，可能是污染細菌，應建議重送標本。⑷當涂片中見到的細菌，并有細菌吞嗜現(xiàn)象存在，在培育時分別出該細菌可推想為致病菌。培育結(jié)果結(jié)合涂片推斷定

植菌或致病菌（5）涂片報告的日期和培育報告日期要對應便于醫(yī)生判別結(jié)果的參考價值.（6）并每一視野可見到>20個/油鏡或該菌占所見到細菌的50%,可推想是標本中的優(yōu)勢細菌.

有了合格的標本是保證培育成功的重要條件，但假如沒有適宜的分別培育基和培育環(huán)境同樣不能獲得好的結(jié)果，為此制定如下基本條例以保證致病細菌分別成功。三.分別培育基本規(guī)范1.痰培育1培育基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭瓊脂或伊紅美蘭、或加MRSA顯色瓊脂。2．培育環(huán)境：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、置5-7%CO2、35℃環(huán)境培育，其他培育基置35℃空氣培育。3．結(jié)核培育：羅氏雞蛋斜面，每一標本種2支，37℃空氣培育。2.尿標本1．培育基：5%羊血瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭，或CP3尿致病菌分別顯色瓊脂。2.菌落計數(shù)：每個標本都要做，用加樣器或定量接種環(huán)取樣本10ul分別接種于上述培育基勻整涂布整個平皿，此日作菌落計數(shù)。3．培育環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培育3.便培育1．

培育基：中國蘭或伊紅美蘭，沙門氏志賀氏瓊脂（SS瓊脂）或加沙門菌分別瓊脂。2．培育環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培育。3．疑似偽膜性腸炎：5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂斜面、梭狀芽孢桿菌分別瓊脂（CCFA）。5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂斜面置35℃空氣環(huán)境培育。CCFA置35℃厭氧環(huán)境培育。其他特殊腸道致病菌培育按國家CDC要求執(zhí)行。4.腦脊液培育1．培育基：5%兔血巧克力瓊脂、5%羊血瓊脂。2．培育環(huán)境：35℃，5-10%CO2環(huán)境培育。5.分泌物培育1．培育基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭、葡萄糖肉湯2．培育環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培育。6.膽汁或胸水或腹水1．培育基：如標本量大時可按血液培育方法干脆取16-20ml分別種入需氧和厭氧培育瓶。如標本量有限，可接種5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭、葡萄糖肉湯。2．培育環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培育。四.細菌鑒定規(guī)范操作1.涂片染色一．涂片染色：應具備最基本的兩種染色技術(shù)，即革蘭氏染色和抗酸染色。1革蘭染色：革蘭染色報告必需包括染色反應或微生物種類和類別，描述物種的形態(tài)或結(jié)構(gòu)。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。涂片染色2.抗酸染色：抗酸染色報告應顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結(jié)果，報告中應以加號體現(xiàn)標本中抗酸桿菌的存在量。如找到抗酸桿菌++；見到染色不典型抗酸桿菌+，建議再送標本。不能報告找到結(jié)核桿菌但可報告未找到結(jié)核桿菌2.趨向性鑒定試驗革蘭陽性球菌:觸酶試驗:3%H2O2用30%的H2O2稀釋10倍后運用，避光4度保存；試驗時設立陽性和陰性比照；1分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡為陽性。凝固酶試驗：接受商品試劑或EDTA抗凝的多個兔混合血漿；測定玻片法測定凝合因子10秒鐘即可視察結(jié)果；測定凝固酶需在37度3-4h，若陰性還應放置24h再視察結(jié)果。革蘭陰性桿菌:氧化酶試驗建議用紙片法保存比較便利；試劑配制：1%鹽酸四甲基對苯二胺水溶液陽性：由粉紅變?yōu)樗{紫色為陽性比照：銅綠假單孢菌ATCC27853+大腸埃希菌ATCC25922-3.血清學試驗腸道致病菌生化特征符合的前提下必需有血清學的試驗作最終確認，基層細菌室應具備1-3項血清試劑。1.志賀氏菌多價和單價凝集血清：2.沙門氏菌多價和單價凝集血清3.致病性大腸桿菌多價和單價凝合血清4.真菌鑒定1．每一基層試驗室必需開展真菌涂片，報告臨床是否找到真菌；是否見到真菌菌絲；從形態(tài)辨別常見絲狀真菌;區(qū)分曲菌或毛霉菌。2．開展酵母樣真菌分別培育，應具備最基本的沙保弱培育基或用顯色培育基，鑒別白念和非白念，隱球菌等。3.有條件的試驗室應開展非培育的鑒定方法，如-D葡聚糖的檢測。五.藥敏試驗的規(guī)范操作1.用CLSI指南舉薦的K—B藥敏標準進行常規(guī)藥敏試驗推斷。2.依據(jù)CLSI更新剛好替換應用的標準。3.依據(jù)CLSI舉薦的方法，開展重要耐藥菌的檢測，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。

－紙片擴散法AST操作步驟制備接種物（0.5麥氏單位）接種（15分鐘內(nèi)接種，涂抹勻整）在接種好的瓊脂平板上貼加紙片

孵育（15分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)平板，35°C空氣孵育）苛養(yǎng)菌5％CO2孵育推斷結(jié)果和說明結(jié)果AST－紙片擴散法判讀結(jié)果將游標卡尺置于反轉(zhuǎn)的平板的背面，測量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。平板應距離一個黑色不反光的背景，并用反射光照明。假如是加血的瓊脂培育基，則應在透射光照射下，打開培育皿蓋，從上表面測量抑菌圈。假如被測菌是葡萄球菌或腸球菌，則應孵育24小時，再在透射光下分別視察苯唑西林或萬古霉素的透亮抑菌圈內(nèi)有無耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長。ESBL初步篩選試驗頭孢泊肟10ugor頭孢他啶30ug氨曲南30ugor頭孢噻肟30ug頭孢曲松30ug藥敏紙片頭孢泊肟抑菌圈<=17mm*頭孢他啶抑菌圈<=22mm氨曲南抑菌圈<=27mm頭孢噻肟抑菌圈<=27mm頭孢曲松抑菌圈<=25mm結(jié)果判讀M-H瓊脂培養(yǎng)基初步篩選實驗方法奇異變形桿菌

ESBL監(jiān)測試驗不適用不適用Ceftriaxone>127CefotaximeNANAAztreonam>122Ceftazidime>1*22*Cefpodoxime稀釋法(μg/ml)紙片擴散法(mm)Drug*P.mirabilis不同于其他菌(比如≤17mmand>4

μg/mlforE.coliandKlebsiellaspp.);NA,不適用CLSIM100-S16;Table2A(M2,M7)43NEWESBL確認試驗ESBL的質(zhì)控頻率篩選試驗和表型確證試驗均可每日進行或每周進行，所選擇菌株為肺克700603或大腸埃希菌25922。

應當留意的是：肺克700603ESBL基因在質(zhì)粒上，應將其凍存于-60℃或以下?？烧T導的克林霉素耐藥(erm-介導)常規(guī)D－試驗:陽性15g紅霉素紙片及2g克林霉素之間距離為15-26.“DTest”–陽性反應2006強調(diào)mecA介導的葡萄球菌耐藥的表型試驗紙片擴散法–用頭孢西丁(CXDD30g)紙片金葡菌–其結(jié)果等于苯唑西林紙片(OXDD)結(jié)果。CoNS–結(jié)果優(yōu)于苯唑西林紙片的結(jié)果。結(jié)果清晰，讀起來比苯唑西林簡潔。報告時仍寫苯唑西林，而不寫頭孢西丁。MIC試驗–仍用苯唑西林藥。43

ConfirmatoryTestsforSuspectedCarbapenemaseProductioninEnterobacteriaceae

2009需證明藥敏試驗的結(jié)果和確認菌種的鑒定CLSI在表格的導言中對ESBL增加了警告“Warning”條文NEW六.質(zhì)量限制的規(guī)范化1．藥物敏感試驗的質(zhì)量限制：應包括30天的初始質(zhì)量穩(wěn)定測試；每周一次的常規(guī)質(zhì)量限制；5天的糾控程序。2．鑒定試劑質(zhì)量限制：購入新的試劑；在更換批號；更換生產(chǎn)廠家；結(jié)果發(fā)生異樣等狀況時均應進行質(zhì)量限制。3．染色液質(zhì)量限制：每天臨床標本染色前應包括染色結(jié)果陽性和陰性的比照物及染色液污染的質(zhì)量檢查。質(zhì)量限制內(nèi)容4．分別培育基：如血瓊脂和巧克力，用肺炎鏈球菌、B-溶血和草綠色溶血的鏈球菌、流感嗜血桿菌、等苛養(yǎng)細菌的標準菌株或經(jīng)標準化試劑已證明結(jié)果正確的菌株進行測試，推斷其分別實力。5.培育箱溫度的質(zhì)量限制：每天第一個開箱和最終離開試驗室均應對培育箱的溫度作記錄；CO2培育箱還應記錄CO2的含量。質(zhì)量限制內(nèi)容6．冰箱溫度記錄：按每一冰箱存放的物品不同設置不同的質(zhì)控范圍，特殊對低溫冰箱；每天記錄一次。7．自動化設備：按廠家供應的SOP文件進行質(zhì)控；在設備軟件升級或修改版本時均應進行質(zhì)量限制程序。8.每一有權(quán)向臨床發(fā)報告的試驗室都應參與全國或省或市級質(zhì)量限制活動。

細菌試驗室應對不同的細菌檢驗報告時間和內(nèi)容應有相應的規(guī)定，并告知臨床各科，依此可防止不明緣由的報告延遲應分兩種報告形式：1.危重感染報告:2.常規(guī)報告:七.臨床細菌室報告制度的規(guī)范

1.涂片報告1.革蘭染色：緊急報告30－６０分鐘報告。報告內(nèi)容應包括染色反應、是細菌或真菌、細菌形態(tài)。有無細胞內(nèi)吞嗜現(xiàn)象，有無菌絲。2.抗酸染色：報告抗酸染色陽性或陰性；菌量以加號表示。