大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

大腸桿菌的培養(yǎng)與分離一、大腸桿菌（E.coli）兼性厭氧的腸道內(nèi)的共生菌群合成維生素B和維生素K，供機體利用；產(chǎn)生大腸桿菌素，抑制腸道致病菌和腐生菌滋生。革蘭氏陰性菌作為一種工程菌，在基因工程技術(shù)中被廣泛采用。例：大規(guī)模生產(chǎn)治療糖尿病的藥物——胰島素細菌的革蘭氏染色

革蘭氏染色法是一種用于細菌的染色法。此法將細菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細胞壁的成分不同。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌培養(yǎng)基（culturemedia）按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出的供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。提供微生物生長的條件：合適的溫度：25-37℃合適的pH：細菌6.5-7.5中性偏堿真菌5.0-6.0中性偏酸營養(yǎng)成分：含有碳源、氮源、生長因子、水和無機鹽。細菌喜葷，霉菌喜素LB培養(yǎng)基的配方培養(yǎng)基成分各成分的量蛋白胨0.5g酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至50ml固體培養(yǎng)基的配制：每50ml液體培養(yǎng)基添加1g瓊脂瓊脂？紅藻中提取的多糖,在98℃以上熔化，44℃以下凝固，常溫下凝結(jié)成有彈性的凝膠。凝固劑固體培養(yǎng)基：菌落單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)?！罹?/p>

液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長無菌操作（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。

（1）消毒：

利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。消毒與滅菌

（2）滅菌：

滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。

以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達到完全無菌的過程。1)消毒：概念：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物。方法:煮沸消毒法化學(xué)藥劑消毒:酒精紫外線消毒（2）滅菌概念：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物。方法：a灼燒滅菌b干熱滅菌c高壓蒸汽滅菌d過濾滅菌（G6玻璃砂漏斗）灼燒滅菌微生物的接種工具(接種環(huán)、接種針)或其他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒注意適用范圍干熱滅菌

160－170℃；1－2h高壓蒸汽滅菌100kPa121℃15min高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌法為濕熱滅菌法，其優(yōu)點有三：

1、濕熱滅菌時菌體蛋白容易變性；

2、濕熱穿透力強；

3、水蒸汽變成水時可放出大量熱增強殺菌效果，因此，它是效果最好的滅菌方法。2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考1二、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗操作（一）培養(yǎng)基的配置與滅菌取2個250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細菌的擴大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細菌的劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進入（二）倒平板滅菌后的培養(yǎng)基在無菌操作臺上倒入4個培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面培養(yǎng)皿壁上不能沾有培養(yǎng)液，否則容易污染。注意事項：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌操作臺用超凈紫外燈和過濾風(fēng)滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.（三）大腸桿菌的擴大培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時。注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.（四）大腸桿菌的劃線分離分離方法:劃線分離法和涂布分離法平板劃線分離法平板劃線的操作不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。單菌落進行恒溫培養(yǎng)時，為什么要將平板倒置？

答：恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿會是水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放培養(yǎng)皿，則水分形成的水滴回落到培養(yǎng)基的表面并且散開。如果培養(yǎng)皿已形成菌落，則菌落中的菌會隨水?dāng)U散，菌落相互影響，很難再分成單菌落，達不到分離的目的。因此，恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿必須倒置。劃線分離法注意事項:1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h

1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.劃線分離法和涂布分離法哪個更好呢？劃線分離：方法簡單，但單菌落較難分開。涂布分離：單菌落更易分開，但操作復(fù)雜。課后思考題1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（3）上述方法較難區(qū)別同類的不同物種，需借助化學(xué)和進一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。3.進行恒溫培養(yǎng)時為什么要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達不到分