mofloXDP流式細胞儀基本原理以及應用

流式細胞儀基本原理以及應用

張宇eckmanCoulter細胞研究必備的儀器細胞成像、定位（單個細胞）細胞定量測定（群體細胞特征）分析型：一個細胞的身世：我是誰混雜的細胞群激光激發(fā)標記在細胞上的熒光素Directlytowaste儀器的電子系統(tǒng)收集熒光信號并處理信號計算機工作站對信號進行收集和統(tǒng)計流式細胞儀是通過對目標細胞上的熒光信號進行識別

而實現(xiàn)對細胞的定量一個細胞的命運混雜的細胞群身份的鑒定識別和通過的速度分選是一個復雜的過程流式細胞儀是細胞組學的定量工具可以做以下定量：細胞相對定量（％）細胞絕對定量（細胞/μl）細胞膜蛋白表達定量（蛋白分子/細胞）流式細胞儀的檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體流式細胞儀基本原理通過激光激發(fā)高速流動的細胞或微粒所攜帶的熒光染料或熒光素，并檢測由此產(chǎn)生各種光信號，如散射光、自發(fā)熒光、特異性熒光的強弱，來反映各項待檢測指標。成功的流式實驗需要三步走：下游實驗,培養(yǎng)或者其他生物手段驗證流式樣本制備單細胞懸液制備樣本保存熒光標記設置對照單細胞懸液制備樣本濃度要求：建議105~106/ml血樣本樣本要求：EDTA、肝素、檸檬酸鈉抗凝全血凝血、溶血樣本應當棄用

白細胞樣本：需裂解去除紅細胞

裂解液的選擇：甲酸作用強，適用于一般檢測

氯化銨作用溫和，適用于低含量細胞

注意：溫度過低會影響裂解效果

紅細胞樣本：PBS或生理鹽水稀釋1000倍

血小板樣本：避免使用肝素抗凝血，PBS或生理鹽水稀釋20倍

培養(yǎng)細胞一般處理：消化分散成單細胞，過300目濾網(wǎng)去除細胞團塊易聚集的細胞：可在緩沖液中加1~3%的小牛血清或BSA或0.05%EDTA

單細胞懸液制備組織細胞脾細胞，在緩沖液中將血洗凈，剪成數(shù)塊，直接在300目濾網(wǎng)上研碎過篩肝、腎組織及結(jié)腸癌等富含實質(zhì)細胞的組織，于緩沖液中充分剪碎，細胞分散于緩沖液中，過100目濾網(wǎng)，再過300目濾網(wǎng)

肺、腸粘膜等結(jié)締組織較多的組織，剪碎并用胰酶、膠原酶等消化分散骨、軟骨、心肌、骨骼肌、腦組織等，可嘗試機械剪碎及酶消化后于培養(yǎng)液中靜置貼壁分離細胞，但可用的細胞往往較少，最好進行原代培養(yǎng)

單細胞懸液制備外周血樣本：在不處理的情況下于4度存放3~5天，仍可用于大多數(shù)表面分子標記檢測。但做細胞絕對計數(shù)應在24h內(nèi)檢測固定：低濃度的甲醛或多聚甲醛固定（<1%）可用于培養(yǎng)細胞或已分散成單細胞的組織來源樣本的短期保存（<1周）

過高濃度的甲醛會影響抗原抗體結(jié)合及導致熒光淬滅，不適合流式檢測長期保存：可參考細胞和組織的凍存（深低溫或液氮）DNA倍體檢測：可用-20度預冷乙醇固定（終濃度>80%），固定時震蕩逐滴加入，避免結(jié)塊，1~2ml/樣本，存放于-20度（>1月）注意：已標記熒光的樣本和對細胞活力有要求的樣本應盡快檢測，以免熒光淬滅及細胞活力喪失樣本保存熒光標記表面抗原標記：抗體用量106cells/test凍干粉可以0.5~1ug/106cells為起始量脂溶性染料：可直接進入細胞內(nèi)細胞內(nèi)抗原標記及水溶性染料：需要膜通透試劑處理膜通透試劑的選擇甲醇：中等，可能導致部分蛋白變性

皂素：溫和，對細胞形態(tài)影響小

Triton-X100：強烈，對細胞形態(tài)影響大

商品化試劑：含有上述多種成分，不同組合用途不同熒光素的選擇激發(fā)波長發(fā)射波長激光熒光通道熒光素的選擇

CD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP<FITC<APC<

ECD<PC5<PC7<PE熒光素的強度熒光檢測通道之間的干擾FITC(F/PRatio3-5)PE(1/Antik?rper)389D240kDECD(F/PRatio1)PC5(F/PRatio1)240kD240kD240kDTexasRed=625DCy5=1500DCy7=1001DPerCP(F/PRatio3-5)35kDAPC(F/PRatio1)105kDPC7(F/PRatio1)熒光素的大小熒光素的選擇原則弱表達抗原選擇較“明亮”的熒光素細胞內(nèi)抗原檢測優(yōu)先選擇小分子熒光素多色檢測時弱表達抗原放在被干擾較小的檢測通道，強表達抗原放在對其他通道干擾較小的檢測通道表達互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道共表達的抗原避免放在相互干擾的通道上級抗原檢測通道避免對下級抗原檢測通道造成干擾SILENTUNTOUCHABLEUNTOUCHABLEUntouchable=其他染料沒有干擾(cleanrow)Silent=不會漏進其他通道(cleancolumn)Distortion矩陣熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)

軟件的手動、自動補償和離線補償

FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2自動補償2134檢測的一般步驟設置檢測方案（PROTOCOL)染色標本（同型對照，補償管，檢測抗體）同型對照管調(diào)電壓電壓不變，補償管調(diào)補償電壓不變，補償不變，上檢測管檢測后直接閱讀結(jié)果，確定分選目的細胞流式細胞儀基本結(jié)構(gòu)Fluidicsopticselectronicsanalyzer液流系統(tǒng)Fluidics流體動力學聚焦原理管路設計光路系統(tǒng)激光濾光片光信號檢測器MoFloXDP光路精致設計，開放性強Filter前向散射角（FS）側(cè)向散射角（SS）電路系統(tǒng)如何看圖DotPlot（雙參數(shù)點圖）Histogram（單參數(shù)直方圖）Region（門）Statistics（統(tǒng)計結(jié)果）分選系統(tǒng)電極板分選倉分選原理（電荷式分選）晶體震動（200kHZ)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)收集裝置（管、孔板）MoFlo?XDP：噴嘴種類多，適合不同研究對象的需要

CytoNozzle

同等大小的羅紋卸載和安裝，簡單易用噴嘴內(nèi)壁由生物活性材料組成，對細胞無損傷，確保最好的細胞活性XDP細胞√染色體/精子/細菌/大病毒顆粒/藻類細胞（50um）√實驗動物細胞/人淋巴細胞/神經(jīng)細胞（70-90um）√腫瘤細胞（100-130um）√巨噬細胞等真核生物細胞（150um）√植物/花粉/大藻類細胞（200um）Enrichmode要得到所有含有目標細胞的液滴Purifymode要得到所有含有目標細胞的液滴，但同時含有非目標細胞的液滴除外Singlemode只要只含有一個目標細胞的液滴目標細胞非目標細胞MoFlo:高度智能的分選模式Dropletscells液滴模式(Envolope)如下原則EnrichModeEnrichModePurifyModePurifyMode四路分選可以分別選擇不同的分選模式獨家的混合分選模式：四路分選分別選擇不同的模式

既有高純度細胞，又不浪費任何一個細胞XDPDataunpublishedShanghai右路：富集模式左路：純化模式Sortedat>70,000epsfor>2hrs

如何設門1.遠離碎片，便于圈門2.分群不清晰，加大電壓軟件去除粘細胞適合所有應用的細胞接收系統(tǒng)

分選角度定位

4路分選Cyclone克隆分選裝置支持任意廠家的標準6,24,96,384,1536微孔板,客戶定制的微孔板,波片客戶任意指定矩陣的細胞芯片，并且操作簡單SummitSoftwareWindowsXP

系統(tǒng)SUMMIT軟件涵蓋所有的數(shù)據(jù)和圖形處理功能SUMMIT軟件以數(shù)據(jù)庫儲存為基礎，支持自動補償，離線補償，多文件分析報告等最先進流式軟件性能SUMMIT軟件完全開放安裝，可以分析所有國際標準LMD/FCS數(shù)據(jù)，方便使用SUMMIT軟件界面簡單，易學易用SUMMIT軟件獨有單參數(shù)圖顏色示蹤功能軟件對分選效果的影響軟件放大功能流式細胞儀的應用支持最全面的生命科學研究內(nèi)容免疫功能研究（包括淋巴細胞亞群分析、細胞絕對計數(shù)、細胞活化、細胞因子、調(diào)節(jié)性T細胞、樹突細胞、抗原特異性T細胞、Th17細胞等）腫瘤相關研究（腫瘤相關基因表達、抗腫瘤藥物作用機制及多藥耐藥等）細胞周期和DNA倍體分析、細胞周期蛋白干細胞研究（干細胞的分離、鑒定、功能分析等）細胞治療藥物篩選、抗體研發(fā)，疫苗評估細胞凋亡及凋亡相關蛋白細胞增殖、轉(zhuǎn)染效率檢測磷酸化蛋白的檢測及信號傳導通路的研究細胞生理功能研究（死活鑒定、細胞內(nèi)pH值、細胞內(nèi)鈣流、膜電位）細胞多色分選0.0017%極低含量的肝癌細胞系HuH7干細胞分析分選。獲取數(shù)量超過1300萬細胞，CD133陽性細胞含量低于1/10萬（0.0017%），總共收集到100多個細胞，直接注射裸鼠皮下進行成瘤觀察Unpulisheddatashanghai極低含量的目標細胞（十萬分之一）需要一次性海量獲取樣本細胞才能檢測到和分選到淋巴細胞亞群的分析和分選T淋巴細胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導性T細胞(Th/Ti)輔助和誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細胞(Th)誘導性T細胞(Ti)輔助細胞免疫和體液免疫誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細胞(Ts/Tc)抑制免疫反應/殺傷異源細胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD8+CD28+抑制性T細胞(Ts)殺傷性T細胞(Tc)抑制細胞和體液免疫細胞毒性T細胞CD3+CD4+CD8+活化的T細胞在T細胞惡性增生時升高CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細胞,其表達/T細胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細胞當免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細胞毒性淋巴細胞的祖細胞時此細胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細胞病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細胞,感染時升高感染時升高活化T淋巴細胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預后較差B淋巴細胞(19+)CD19+CD23+活化的B細胞過敏患者中升高

CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高

CD19+CD5+CD23+慢性B細胞白血病及單克隆B淋巴細胞

NK細胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低,而病毒感染時升高

CD3+CD57+CMV(巨細胞病毒)感染的強烈征兆

注意事項1.裂紅完全SSFS2.CD45/SS設門分選CD44FITC/CD133PE細胞(腫瘤干細胞）從香港空運到上海的手術腫瘤切塊，分離成單個細胞后進行染色、檢測和分選MoFloXDP，二軍大分選后的細胞皮下注射研究干細胞致瘤性SortedCD44SortedCD133兩個月后結(jié)果：表達CD44的細胞的致瘤性強于表達CD133的細胞MoFloXDP，二軍大細胞周期分析/DNA含量分析G0/G1SG2/MG0：靜止期，G1：DNA合成前期，S：DNA合成期G2：DNA合成后期，M：有絲分裂期推薦設門：注意事項：1.“細胞去哪里了”？2.固定必須用70%冰乙醇，固定時間2h以上3.乙醇清洗干凈，否則影響RNase的