實時熒光定量RTPCR檢測人外周血單個核細(xì)胞中FOXP3mRNA的表達(dá)

實時熒光定量RT-PCR檢測人外周血單個核

細(xì)胞中F0XP3mRNA的表達(dá)蔣衛(wèi)平，丁茂文，朱亞非，李冰，朱晚林，李欣華，林菲菲【摘要】目的：成立實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反映(real-timefluorescencequantitativeRT-PCR)檢測人外周血單個核細(xì)胞中FOXP3mRNA的方式，并研究其與CD4+CD25+Treg細(xì)胞活性相關(guān)性。方式：提取人外周血單個核細(xì)胞總RNA,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以B-actin為內(nèi)參照，實時熒光定量RT-PCR檢測29例哮喘患兒及24例同齡對照FOXP3mRNA的相對表達(dá)量，采納融解曲線和瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物特異性；同時采納流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量，分析二者相關(guān)性。結(jié)果：哮喘患兒組CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分率明顯低于同齡對照組，PV；FOXP3mRNA的表達(dá)也顯著降低，PV；FOXP3和B-actin的融解曲線分析說明均僅有單一峰,Tm值別離為°C和C；瓊脂糖電泳顯示都僅有單一擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)論：應(yīng)用SYBRGreenI實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測FOXP3mRNA表達(dá)水平簡便易行、結(jié)果穩(wěn)固靠得住。初步結(jié)果證明，外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和FOXP3mRNA表達(dá)有相同的趨勢，存在必然的相關(guān)性?！娟P(guān)鍵詞】實時熒光定量RT-PCR；哮喘；FOXP3；CD4+CD25+調(diào)劑性T細(xì)胞Abstract:Objective:Toestablishareal-timefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction（RT-PCR）todetectFOXP3mRNAexpressioninhumanperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）andtoinvestigatethecorrelationsbetweenactivityofCD4+CD25+regulatoryTcellsandexpressionofFOXP3mRNA.Methods:TotalRNAwasextractedwithTrizolfromhumanPBMCsandmRNAwastranscribedreverselyintocDNA.Real-timefluorescentquantitativeRT-PCRwithB-actinastheinternalcontrolgenewasusedtodetecttheexpressionlevelsofFOXP3mRNAin29pediatricpatientswithasthmaand24age-matchedhealthychildren.ThespecificityofPCRproductionswasidentifiedwiththedissociationcurvesandagarosegelelectrophoresis.FlowcytometryanalysiswasusedtoassessthepercentageofCD4+CD25+regulatoryTcells.Thecorrelationbetweentheexpressionandactivitywasanalyzed.Results:ThepercentagesofCD4+CD25+regulatoryTcellsingroupofasthmaweresignificantlylowerthanthoseingroupofcontrol（P<，sodidtheexpressionsofFOXP3mRNA（P<.TheanalysisofdissociationcurvesonFOXP3andB-actinshowedthatbothofthemhadonlyonesimplespikeandtheTmvalueswere°Cand°C,respectively.TheagarosegelelectrophoresisofthemshowedonlysinglePCRproducteach.Conclusion:ItisaneasyandreliabletesttodetecttheexpressionlevelofFOXP3mRNAbySYBRGreenIreal-timefluorescencequantitativeRT-PCRandthepreliminaryexperimentalresultshowsthatthepercentagesofCD4+CD25+regulatoryTcellsandtheexpressionsofFOXP3mRNAhavethesametrendandconfirmsthecorrelationbetweenthem.Keywords:real-timefluorescencequantitativeRT-PCR；asthma；forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor；CD4+CD25+regulatoryTcellsCD4+CD25+調(diào)劑性T細(xì)胞（Treg）是具有免疫抑制功能的一群T細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)、免疫耐受和避免自身免疫性疾病的發(fā)生方面具有十分重要的作用，叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor，F(xiàn)0XP3）特異地高表達(dá)于CD4+CD25+Treg，介導(dǎo)CD4+CD25+Treg在胸腺的發(fā)育、外周的表達(dá)及功能的維持，可反映CD4+CD25+Treg活性水平［1-3］。支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）和肥大細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與的氣道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病進(jìn)程與效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞尤其是II型輔助性T細(xì)胞（Th2）活化并分泌多種細(xì)胞因子緊密相關(guān)；CD4+CD25+Treg可能通過其免疫抑制功能抑制Th2細(xì)胞的活化而阻止哮喘的發(fā)生和進(jìn)展［4］。本實驗成立了SYBRGreenI實時熒光定量RT-PCR檢測人外周血單個核細(xì)胞中F0XP3mRNA的表達(dá)，并驗證了其與流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Treg表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)報導(dǎo)如下。1材料和方式材料標(biāo)本來源：2020年2月至5月在我院小兒科就醫(yī)的29例哮喘患兒（病程2?8年）及24例正常對照共計53例，年齡3?14歲，平均（6±2）歲，其中男32例，女21例，患兒診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)會呼吸組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，正常同齡對照組均為無過敏性疾病史的健康兒童；別離采取兩管EDTA抗凝的靜脈血2mL，及時送檢。要緊儀器：BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀，羅氏LightCycler熒光PCR儀，電泳分析系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)。試劑：多甲藻素葉綠素蛋白（PerCP）標(biāo)記的CD45單克隆抗體（McAb）、人異硫氰酸熒光（FITC）標(biāo)記的CD4McAb、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的CD25McAb均購自美國BDPharMingen公司；淋巴細(xì)胞分離液購自上海華精生物高科技；總RNA提取試劑盒Trizol、第一鏈cDNA合成試劑盒、熱啟動熒光定量PCR核心試劑盒（SYBRGreenI染料法）均購自上海閃晶分子生物科技；引物序列由上海閃晶分子生物科技合成純化。方式流式細(xì)胞儀檢測外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例：別離加入6uLPerCP標(biāo)記的CD45McAb、10卩LFITC標(biāo)記的CD4McAb和PE標(biāo)記的CD25McAb于50uL的EDTA抗凝血中，避光孵育15min，加入溶血素，避光溶血10分鐘，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，1200r/min離心5min，棄上清，再用500uLPBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀（BD公司）檢測，結(jié)果用CellQuest軟件處置。引物設(shè)計：依照GeneBank提供的FOXP3mRNA序列（GeneBank號：AF277993）和B-actin序列（GeneBank號：AY399813）設(shè)計引物。目的基因FOXP3引物：上游（5'to3'）F：CTGACCAAGGCTTCATCTGTG，下游（5'to3'）R：ACTCTGGGAATGTGCTGTTTC，擴(kuò)增片段長度為176bp，內(nèi)參基因B-actin引物：上游（5'to3'）F：TGACGTGGACATCCGCAAAG，下游（5'to3'）R：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG，擴(kuò)增片段長度為205bp。淋巴細(xì)胞分離：取2mL的EDTA抗凝血加2mL淋巴細(xì)胞分離液，倒置混勻，然后在2000r/min離心20min?？俁NA提?。孩倬栉∩鲜龇蛛x的中間層白細(xì)胞（單個核細(xì)胞）放入mL離心管（RNase-Free）中，然后加入ImLTrizol,倒置混勻后，室溫放置5min,使其充割裂解，最后放入-80°C冰箱保留備用。②將所有冰箱里的標(biāo)本掏出室溫解凍后，12000r/min離心5min,棄沉淀。③加入200卩L氯仿（4C預(yù)冷），倒置混勻后室溫放置15min,4C12000r/min離心15min。④吸取上層水相至另一離心管（RNase-Free）中，加入mL異丙醇（-20C預(yù)冷）倒置混勻數(shù)次，室溫放置5~10min，4C12000r/min離心10min，棄上清,RNA沉于管底。⑤加入75%乙醇（-20C預(yù)冷），溫和振蕩離心管,懸浮沉淀，4C8000r/min離心5min,盡可能棄上清。⑥室溫晾干或真空干燥5?10min,最后加入50uLDEPC處置的H2O,適當(dāng)混勻，稍事離心備用。逆轉(zhuǎn)錄：①取上述RNA提取物8uL加入1uL0ligo（dT）18primer,警惕混勻，65C保溫5min,室溫放置10min,室溫高速離心5s,將所有溶液搜集到管底。②順順序別離加入以下試劑：2XFirst-StrandBuffer10uL,RT-mix1uL,整體積為20uL。警惕混勻稍事離心，42C50min,然后90C處置5min,冰上冷卻，室溫咼速離心5s,將所有溶液搜集到管底，-20°C保留備用。熒光定量PCR反映體系：①HotstartFluo-PCRmix：10uL,②上游引物(50pmol/uL)：uL,③下游引物(50pmol/uL)：uL,④無菌去離子水：uL,⑤上述逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA：2uL；一個反映體系的整體積為20uL。擴(kuò)增條件設(shè)置①93C預(yù)變性2min；②93C變性15s,60C退火20s,72C延伸30s,40個循環(huán)，每一個循環(huán)延伸后搜集一次熒光，分析模式設(shè)定為定量分析；③93C變性15sec,72C延伸1min，最后設(shè)定溫度93C,溫度轉(zhuǎn)變速度為C/sec，持續(xù)監(jiān)測熒光，進(jìn)行熔解曲線分析。儀器檢測通道選擇F1通道。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析:①將擴(kuò)增后的毛細(xì)反映管警惕開蓋倒扣在mL的離心管中，4000r/min離心20s,將產(chǎn)物全數(shù)搜集到離心管中。②配1%瓊脂糖凝膠，制成電泳膠板(分子克隆實驗指南)，取5uL擴(kuò)增產(chǎn)物加luLloadingbuffer混勻后上樣，在100V的電壓下電泳20min,最后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照成像。結(jié)果計算：用相對定量的研究方式分析實驗結(jié)果。FOXP3/&-actin比值采納2—△Ct方式計算，二Ctl—Ct2。統(tǒng)計學(xué)處置方式：經(jīng)方差齊性查驗后，采納t查驗比較兩組間不同，用簡單直線相關(guān)分析探討兩因素之間相關(guān)性。2結(jié)果熒光定量方式學(xué)評判①特異性F0XP3和B-actin擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,可見約176bp和205bp特異性條帶顯現(xiàn)，與理論上的目的片段長度完全一致，同時進(jìn)行熔解曲線分析，判定F0XP3和B-actin均只有一尖峰，解鏈溫度（Tm值）別離為°C和°C,說明別離僅有一擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖1?3）。②線性范圍與最低檢測限定量濃度用Ct值的負(fù)對數(shù)表示，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行10倍倍比稀釋，最低檢測限為反映，線性范圍為?反映，相當(dāng)于Ct值從18到37的跨度，相關(guān)系數(shù)為。③周密度：取2份濃度高低不同（Ct值為21和35）的標(biāo)本重復(fù)測定4次,測定結(jié)果經(jīng)對數(shù)處置后其批內(nèi)CV值為?％,批間CV值為?％。哮喘患兒CD4+CD25+Treg明顯下降29例哮喘患兒與24例正常兒童CD4+CD25+Treg檢測結(jié)果別離為（土）％和（土）％，不同有顯著性（PV）。哮喘患兒FOXP3mRNA改變29例哮喘患兒與24例正常兒童F0XP3/B-actin的2-△Ct值別離為土和土，二者不同也有顯著性（PV）。FOXP3mRNA與CD4+CD25+Treg二者相關(guān)性分析FOXP3mRNA在外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)與CD4+CD25+Treg在淋巴細(xì)胞中的比例呈必然的正相關(guān)（r=,PV,見圖4）。3討論隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)研究的深切，愈來愈多的證聽說明免疫功能紊亂在兒童支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，尤其是淋巴細(xì)胞亞群的比例和功能紊亂更是當(dāng)前關(guān)注的熱點。眾所周知，免疫耐受的破壞和Thl/Th2功能失調(diào)是哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。目前以為CD4+CD25+Treg是機(jī)體免疫系統(tǒng)維持外周耐受的重要調(diào)控者，維持其正常的水平和功能將有助于免疫系統(tǒng)對自身抗原的刺激成立良好的耐受狀態(tài)，從而可抑制哮喘的發(fā)生［6］。FOXP3作為一特殊的轉(zhuǎn)錄因子特異地高表達(dá)于CD4+CD25+Treg上，與其發(fā)育和功能成熟緊密相關(guān)［7-8］。咱們通過流式細(xì)胞儀和實時熒光定量RT-PCR檢測發(fā)覺，哮喘患兒外周血CD4+CD25+Treg的比例及F0XP3mRNA的表達(dá)低于同年齡的正常對照組，說明哮喘患兒由于CD4+CD25+Treg數(shù)量不足，免疫抑制功能下降，致使效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞尤其是Th2細(xì)胞大量活化，產(chǎn)生大量致炎因子致使哮喘發(fā)作或持續(xù)；能夠假想，這種患者通過醫(yī)治或自然減緩后，CD4+CD25+Treg數(shù)量和F0XP3mRNA的表達(dá)升高，接近于正常水平，發(fā)揮其免疫抑制功能，抑制Th2細(xì)胞活化，糾正Thl/Th2失衡，增進(jìn)哮喘減緩，提示CD4+CD25+Treg參與了哮喘的發(fā)生和進(jìn)展。SYBRGreenI實時定量PCR與一般PCR相較，具有靈敏、快速、特異的特點。因無需合成特異探針，利用方便；但同時非特異產(chǎn)物可干擾靶基因的產(chǎn)物定量。SYBRGreenI是一種熒光染料，能非特異性地結(jié)合到雙鏈DNA中去，一旦結(jié)合到雙鏈DNA中后即能夠發(fā)出熒光，結(jié)合狀態(tài)的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)強(qiáng)百余倍，因此能夠依照熒光信號強(qiáng)度定量檢測雙鏈DNA數(shù)量?？墒荢YBRGreenI與雙鏈DNA結(jié)合缺乏特異性，在PCR反映中非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，可能會發(fā)生假陽性。為了幸免這種不利因素，本研究在定量反映終止后進(jìn)行融解曲線分析，以區(qū)分由PCR產(chǎn)物和本底造成的熒光信號。分析PCR產(chǎn)物的融解曲線能夠證明擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，特異PCR產(chǎn)物在融解曲線上是單一峰，其Tm值較非目的產(chǎn)物高［9］。咱們發(fā)覺，F(xiàn)OXP3和B-actin的融解曲線均僅有單一峰，Tm值別離為°C和°C；瓊脂糖電泳進(jìn)一步證明了其擴(kuò)增特異性。本文初步結(jié)果證明，外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和F0XP3mRNA表達(dá)有相同的趨勢，存在必然的相關(guān)性。咱們成立了一種從外周血單個核細(xì)胞中檢測FOXP3mRNA的方式，其方式簡單，重復(fù)性好，并有很高的靈敏性和特異性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】FontenotJD,GavinMA,RudenskyprogramsthedevelopmentandfunctionofCD4+CD25+regulatoryTcells[J].NatImmunol,2003,4(4):330-336.KhattriR,CoxT,YasaykoSA,etalAnessentialroleforscurfininCD4+CD25+Tregulatorycells[J].NatImmunol,2003,4(4):337-342.HoriS,Nomura