第二章 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

基因工程《基因工程》第一章導(dǎo)論第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第三章基因克隆的載體第四章基因工程的主要技術(shù)及其原理第五章目的基因的獲得第六章大腸桿菌基因工程高效表達(dá)第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第四節(jié)核酸酶第五節(jié)修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用50年代初發(fā)現(xiàn)了由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象(B)(K)大腸桿菌B大腸桿菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplatingK限制—修飾的酶學(xué)假說(B)(B)B酶切位點(diǎn)不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點(diǎn)被修飾Methylation基因組DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan從大腸桿菌K和B中發(fā)現(xiàn)了I型限制性核酸內(nèi)切酶；1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個(gè)II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的概念

限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases）：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。已經(jīng)從近300中微生物中分離出了500余種限制性核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶的分類1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點(diǎn)5.特異性切割6.基因克隆中I型單一多功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點(diǎn)1000bp不是無(wú)用II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+特異性位點(diǎn)及其附近是非常有用III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點(diǎn)3‘端24-26bp處是有用限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶2、識(shí)別序列的對(duì)稱性識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)II型限制性核酸內(nèi)切酶的3大特點(diǎn)1、識(shí)別位點(diǎn)的特異性

每種酶都有其特定的DNA識(shí)別位點(diǎn)，通常是由4、5、6或7個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。

回文序列中的單鏈可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)雙鏈回文序列可形成十字架結(jié)構(gòu)3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性

雙鏈DNA被酶切后，分布在兩條鏈上的切割位點(diǎn)旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。粘性末端

cohesive

ends因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上不同（對(duì)稱）酶切后形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個(gè)粘性末端很

容易通過互補(bǔ)堿基的配對(duì)而重新連接起來(lái)。平末端

Bluntend因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結(jié)構(gòu)，這種末端不易重新連接起來(lái)。同裂酶

isoschizomers能識(shí)別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同內(nèi)切酶。同尾酶

isocaudamers識(shí)別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。注意：由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP

經(jīng)同尾酶消化的DNA末端連接示意圖5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXA

GATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

一個(gè)酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37℃）下，50L反應(yīng)體系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的純度和甲基化程度B。甘油的含量（不超過5%）C。反應(yīng)體系中的離子強(qiáng)度D。反應(yīng)體系的pH值F。反應(yīng)的溫度條件（通常為37℃

）酶單位的定義和影響酶活性的因素Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

酶切反應(yīng)的基本步驟＋－電泳紫外分析37℃1h加反應(yīng)液CKMBuffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第四節(jié)修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、DNA連接酶作用的特點(diǎn)2、DNA連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種Nick的酶存在。

1967年，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條

DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶——DNA連接酶（ligase）。DNA連接酶由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子；T4DNA連接酶由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。（1970年）容易制備，而且可以連接完全配對(duì)的平末端DNA分子，所以在基因克隆中應(yīng)用廣泛。NickNickDNA連接酶作用的特點(diǎn)A.連接的兩條鏈必須分別具有3′端自由羥基（-OH）和5′端磷酸基團(tuán)（-P），而且只有這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰時(shí)才能進(jìn)行連接反應(yīng)；B.在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程，因此連接反應(yīng)必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，即ATP和NAD+。OKNODNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶1、DNA連接酶作用的機(jī)理2、DNA連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用DNA連接反應(yīng)的條件

連接反應(yīng)最佳溫度為37℃，但是此時(shí)粘性末端間氫鍵結(jié)合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會(huì)迅速降低。比如，EcoRI粘性末端連接部位只有4個(gè)堿基對(duì)，很容易斷開。所以通常在4-15℃連接。影響連接效率的因素有：A.溫度（最主要的因素）B.ATP的濃度(10M-1M)C.連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）D.反應(yīng)時(shí)間（通常連接過夜）E.插入片段和載體片段的摩爾比轉(zhuǎn)化4℃過夜加反應(yīng)液CK-重組菌落CK+1、DNA連接酶作用的機(jī)理2、DNA連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用粘性末端DNA片段的連接NickNick平末端DNA片段的末端加尾連接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶平末端DNA片段加接頭連接法

銜接物(linker)，也叫接頭，是有人工化學(xué)合成的一段10-12個(gè)核苷酸的DNA雙鏈，其中包含有1個(gè)或幾個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。使用時(shí)只須將銜接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第四節(jié)修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用

大腸桿菌DNA聚合酶I

（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先從大腸桿菌E。Coli細(xì)胞中分離出來(lái)的。它是一種多功能性的酶，包括3種不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性以雙鏈DNA為模板，催化單核苷酸結(jié)合到引物的3′末端，并不斷延伸。5′-3′外切酶活性將雙鏈DNA中游離的5′末端逐個(gè)切去。3′-5′外切酶活性將游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過對(duì)于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T

大腸桿菌DNA聚合酶I的三種用途A.制備高比活度的DNA探針

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA連接后的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。

大腸桿菌聚合酶I的應(yīng)用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+缺口轉(zhuǎn)移(Nicktranslation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCT1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用

Klenow片段的主要用途Klenow片段大腸桿菌聚合酶I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理獲得N端三分之二的大肽段，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途修補(bǔ)限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端同位素標(biāo)記DNA片段的末端cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列GAACTTAADNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用

T4DNA聚合酶的特點(diǎn)T4DNA聚合酶是

從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來(lái)的，它和Klenow片段一樣具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶I的活性高200倍.T4-DNA酶的基本特性：1

5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性2在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3‘-OH端外切3在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止4在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位

T4DNA聚合酶的用途1、以取代反應(yīng)標(biāo)記延伸末端或平頭末端的雙鏈DNA片段2、切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端3、

DNA片段的同位素末端標(biāo)記T4DNA聚合酶活力—取代反應(yīng)：如果反應(yīng)體系中僅存在一種dNTP，這時(shí)T4DNA聚合酶就會(huì)表現(xiàn)出3′→5′外切酶活力，從雙鏈DNA的3′開始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互補(bǔ)的堿基，然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGdTTPMg++CGGCAGCGdTTPMg++T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用

逆轉(zhuǎn)錄酶—Reversetranscriptase逆轉(zhuǎn)錄酶是

一種可以有效地將mRNA轉(zhuǎn)錄成為DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(complementaryDNA).實(shí)際上，它也是一種RNA依賴的DNA聚合酶。逆轉(zhuǎn)錄酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩個(gè)課題組的論文都發(fā)在了同一期的《Nature》雜志上。主要用途是

將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基因片段。3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第四節(jié)修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）4、堿性磷酸化酶第四節(jié)修飾性工具酶末端轉(zhuǎn)移酶的特性末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）來(lái)自小牛胸腺該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，隨機(jī)摻入dNTPs，將核苷酸連接到DNA的在3‘羥基，特別是對(duì)于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有效。最常見的用途是在酶切產(chǎn)生的平末端加尾以便于創(chuàng)造粘性的互補(bǔ)末端。平末端DNA片段的末端加尾連接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶1、末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）3、堿性磷酸化酶（Alkalinephosphatase）第四節(jié)修飾性工具酶核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

發(fā)夾結(jié)構(gòu)的切除TTAAAATT單鏈尾巴的切除1、末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltra