第三章 核酸化學(xué)

第三章核酸化學(xué)唐巧玉2011年秋核酸作為遺傳物質(zhì)的證實(shí)與核酸的分類(lèi)核苷酸結(jié)構(gòu)與功能核酸結(jié)構(gòu)核酸性質(zhì)及研究方法第一節(jié)核酸作為遺傳物質(zhì)的證實(shí)與核酸的分類(lèi)核酸是一類(lèi)重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。1核酸作為遺傳物質(zhì)的證實(shí)－－核酸的研究發(fā)現(xiàn)史1868年，F(xiàn).Miescher（瑞士）首次在繃帶上的膿細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)一種富含磷酸呈酸性又不溶于酸溶液的分子，命名為核素（nuclein

），其實(shí)是核蛋白。JohannFriedrichMiescherSwissbiochemist(1844–1895)PhysiologicalLaboratoryoftheUniversityofBasel1889年，R.Altman從酵母和小牛的胸腺中提取了一種溶于堿性溶液中的純凈物，這才是真正的核酸。從此，對(duì)核酸的研究全面展開(kāi)，揭開(kāi)了生物化學(xué)領(lǐng)域驚天動(dòng)地的一頁(yè)。1928年，GriffithF.首次發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌（Streptococcuspneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。FrederickGriffith(1879-1941)Griffith'sexperiments(1928)firstdemonstratedthatgeneticinformationcouldbetransferred.Withoutknowingwhatthisinformationwas,hecalleditthe"TransformingPrinciple".

1944年，OswaldTheodoreAvery等在離體條件下重復(fù)這一實(shí)驗(yàn)，并對(duì)轉(zhuǎn)化本質(zhì)進(jìn)行了研究。①DNA的純度越高，轉(zhuǎn)化就越有效。②用DNA酶處理DNA，S型死細(xì)菌就不能使R型細(xì)菌發(fā)生轉(zhuǎn)化。discovering1952年，Hershey&Chase用E.coli,phageT2做材料，利用同位素示蹤法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。AlfredD.Hershey（1908－1997）AlfredHersheyandMarthaChasedidtheHershey-ChaseblenderexperimentthatprovedphageDNA,andnotprotein,wasthegeneticmaterial.AlfredHersheyandMarthaChase（1928-2003）1953TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969Hershey-ChaseblenderexperimentDNA是遺傳物質(zhì)?。onclusion2核酸的種類(lèi)和分布脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核酸分為兩大類(lèi)：核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）

DNA真核原核98％核中（染色體中）線(xiàn)粒體（mDNA）葉綠體（ctDNA）擬核核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒核外主要的RNA種類(lèi)縮寫(xiě)全稱(chēng)功能存在mRNA信使RNA翻譯模板所有細(xì)胞tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)RNA氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)所有細(xì)胞rRNA核糖體RNA核糖體組分所有細(xì)胞hnRNA核內(nèi)不均一RNA信使RNA前體真核細(xì)胞snRNA核內(nèi)小分子RNA參與pre-mRNA剪接真核細(xì)胞snoRNA核仁小分子RNA參與per-rRNA加工真核細(xì)胞miRNA微RNA調(diào)節(jié)mRNA翻譯原核細(xì)胞RNAi干擾RNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)真核細(xì)胞第二節(jié)核苷酸結(jié)構(gòu)1核苷酸的組成核苷酸核苷磷酸戊糖堿基嘌呤：A、G嘧啶：C、U、Tβ-D-2-脫氧核糖β-D-核糖1.1戊糖醛β-呋喃糖在溶液中β-D-核糖和β-D-2-脫氧核糖都可發(fā)生環(huán)狀和直鏈分子的互換。但在RNA和DNA中只存在環(huán)狀分子。β-D-2-脫氧核糖β-D-核糖1.2核酸分子中常見(jiàn)堿基嘧啶嘌呤衍生衍生1.3核酸分子中稀有堿基次黃嘌呤（Hypoxanthine）黃嘌呤（Xanthine）尿酸uricacid二氫尿嘧啶dihydrouracil7-甲基鳥(niǎo)嘌呤1.5核苷堿基與戊糖形成糖苷鍵，核苷具有高度親水性和堿性條件下的穩(wěn)定性。嘧啶核苷可抗酸水解，而嘌呤核苷易發(fā)生酸水解。核苷的構(gòu)象順式腺嘌呤核苷syn-adenosine反式腺嘌呤核苷anti-adenosineDNA和RNA中嘌呤核苷主要是反式構(gòu)象順式鳥(niǎo)嘌呤核苷syn-guanosine反式鳥(niǎo)嘌呤核苷anti-adenosinesyn-anti-嘧啶環(huán)O-2和戊糖C-5之間空間位阻，使得嘧啶核苷常為反式構(gòu)象1.6核苷酸常見(jiàn)核苷酸常見(jiàn)脫氧核苷酸核苷酸的存在形式2核苷酸的功能①能量貨幣（ATP）②遺傳物質(zhì)合成的前體③信息轉(zhuǎn)導(dǎo)中的信號(hào)分子④作為其它物質(zhì)的前體或輔酶/輔基的成分⑤代謝活化的中間物⑥作為酶的別構(gòu)效應(yīng)物參與代謝調(diào)節(jié)⑦調(diào)節(jié)基因表達(dá)第三節(jié)核酸結(jié)構(gòu)1核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)5′未端3′未端核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)特征①核酸具有方向或極性②核酸在生理pH下帶電荷③核酸堿基的有序性pA-C-G-T-AOH、pApCpGpTpA、pACGTA核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指構(gòu)成核酸鏈上的所有核苷酸殘基或堿基的排列順序核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)書(shū)寫(xiě)方式有2DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1950年，Chargaff應(yīng)用紫外分光光度法結(jié)合紙層析等簡(jiǎn)單技術(shù)，對(duì)多種生物DNA作堿基定量分析，總結(jié)了DNA堿基組成“Chargaff規(guī)則”ErwinChargaff1905-20022.1Chargaff規(guī)則不同生物來(lái)源的DNA四種堿基比例關(guān)系DNA來(lái)源腺嘌呤A胸腺嘧啶T鳥(niǎo)嘌呤G胞嘧啶C（A+T）/（G+C）大腸桿菌25.424.824.125.71.01小麥27.327.122.822.71.21鼠28.628.421.421.51.33豬：肝29.429.720.520.51.43胸腺30.028.920.420.7脾29.629.220.420.8酵母31.332.918.717.51.079①不同生物來(lái)源的DNA堿基組成不同②同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同③同一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變④在所有生物的DNA，無(wú)論種屬來(lái)源如何，其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相同A=T，鳥(niǎo)嘌呤摩爾含量與胞嘧啶摩爾含量相同G=C?？偟泥堰誓柡颗c總的嘧啶摩爾含量相同，即A＋G=C＋T。ChargaffRules2.2DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的揭示FrancisCrick(35y)1953JamesWatson(23y)丹麥哥本哈根劍橋大學(xué)CavendishLab.－－生命科學(xué)的重要里程碑RosalindElsieFranklin(1920-1958)

MauriceHughFrederickWilkins

2.3DNA的B-型雙螺旋結(jié)構(gòu)①DNA是由兩條呈反向平行的多聚核苷酸鏈組成，一股鏈?zhǔn)?′→3′走向，另一股鏈?zhǔn)?′→5′走向。②鏈的骨架(backbone)由交替出現(xiàn)的親水的脫氧核糖基和磷酸基構(gòu)成，位于雙螺旋的外側(cè)。堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，兩股鏈中的嘌呤和嘧啶堿基以其疏水的、近于平面的環(huán)形結(jié)構(gòu)彼此密切相近，平面與雙螺旋的長(zhǎng)軸相垂直。③一股鏈的嘌呤堿基與另一股鏈中位于同一平面的嘧啶堿基之間以氫鏈相連，稱(chēng)為堿基互補(bǔ)配對(duì)或堿基配對(duì)(basepairing)。堿基互補(bǔ)配對(duì)總是出現(xiàn)于A與T之間(A=T)，形成兩個(gè)氫鍵；或者出現(xiàn)于G與C之間(G=C)，形成三個(gè)氫鍵。④兩股DNA鏈圍繞一假想的共同軸心形成一右手螺旋結(jié)構(gòu)，雙螺旋的螺距為3.4nm，雙螺旋每轉(zhuǎn)一周為10堿基對(duì)（bp），堿基對(duì)層間的距離為0.34nm。雙螺旋直徑為2.0nm。2.2nmmajorgroove1.2nmminorgroove⑤表面形成一條大溝，一條小溝。

大溝與小溝是蛋白質(zhì)識(shí)別DNA的堿基序列，與其發(fā)生作用的基礎(chǔ)。ThehomeodomainoftheEngrailedproteinbindstoaparticularsiteintheDNA.Helix3contactsthebasepairsinthemajorgroove,whiletheamino-terminalportionofthehomeodomainenterstheminorgroove.TheHMG-I(Y)DNA-bendingproteinwrapsa60-base-paircoilofDNAaroundthetranscriptionalactivatorsNF-kB(thep50/p65complex),IRF1,andATF2/c-Jun.TheHMG-I(Y)isintheminorgroove,whiletheothertranscriptionfactorsoperateinthemajorgrooveofthedoublehelix.Oncetheenhanceosomeisassembled,itcontactsthebasaltranscriptionapparatusatseveralsites.結(jié)構(gòu)回顧2.4A型雙螺旋DNA在75%相對(duì)濕度的鈉鹽中形成A-DNA螺旋的構(gòu)型。A-DNA螺旋是右手螺旋螺旋一周11bp，螺距2.46nm，螺旋直徑2.6nm堿基平面與螺旋軸成19°夾角，大溝窄而深，小溝寬而淺。DNA與RNA的雜分子和RNA雙鏈為A型雙螺旋2.5Z-型雙螺旋DNAZ-DNA螺旋是左手螺旋1979.AlecxanderRich美國(guó)麻省理工學(xué)院教授GCGCGC在高鹽條件下形成可能的功能

與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)Z-DNA

(小溝極度窄而深，信息少)

基因關(guān)閉

B-DNA

(大溝很寬，深度中等,信息多)

基因表達(dá)

DNA的分子構(gòu)型(B,Z,A)比較

FormBZAHelixDirectionRightLeftRightbp/circle101210.7Distance/bp~0.34nm~0.38nm~0.25nmDistance/helix3.4nm4.46nm2.8nmDiameter/helix2.0nm1.8nm1.9nmSequenceAnyPolyG-CAnyPolyC-APolyT-GPolyT-A

ConditionNormal4MNa+DNA-NaCryticD.SRNADNA/RNA

C2,C3/PuC2-endoC3-endo

GrooveMinorN7,C8outerMinorMajorMajorMinordeeper

deeperConformationA,G-antiA,G-synA,G-anti(dGMP,dAMP)C,T-antiT,C-antiT,C-anti

FormBZA2.6雙螺旋穩(wěn)定的力（ForcesthathelptoformtheDNAdoublehelix）氫鍵（Hydrogenbondingisnotthemostenergticallysignicantcomponentnote:maintenanceofdistancefromthetwophosphatebackbonerequiresPur-Pyr）堿基堆積力（Stackinginteractions-electronicinteractionsbetweenplanarbases）磷酸骨架的剛性（Rigidphosphatebackbone）離子鍵（Ionicinteractions-saltstabilizestheduplexformofDNAshieldingofphosphatebackbone）

疏水作用（Hydrophobicinteractions-highlynegativephosphatebackbonevs.nonpolarbases）2.7與DNA堿基順序相關(guān)的特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)

回文序列指含有反向重復(fù)（invertedrepeat）堿基序列的一個(gè)DNA區(qū)域，DNA雙鏈呈二重對(duì)稱(chēng)。①回文序列（palindrome）DNA片段旋轉(zhuǎn)180°后，順序不變回文序列中的單鏈可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)雙鏈可形成十字架結(jié)構(gòu)這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)或十字架結(jié)構(gòu)在大腸桿菌細(xì)胞DNA中已有發(fā)現(xiàn)②鏡象重復(fù)（mirrorrepeat）結(jié)構(gòu)鏡象重復(fù)指每條DNA鏈內(nèi)存在的反向重復(fù)序列③三股螺旋（triplexDNA,H-DNA）多嘌呤-多嘧啶的鏡象序列可形成三螺旋結(jié)構(gòu)(H-螺旋或Hoogsteen螺旋)參與三股螺旋DNA氫鍵的原子稱(chēng)為Hoogsteen位點(diǎn)，為有嘌呤的N-7、為O6和N6這種非Watson-Crick配對(duì)稱(chēng)為Hoogsteen配對(duì)三股螺旋（tripleDNA）可分為分子內(nèi)的三股螺旋、分子間的三股螺旋和平行三股螺旋

1987年Mirkin.S.M

Nature330(495)證明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在

分子內(nèi)的三股螺旋由于分子內(nèi)的三股螺旋結(jié)構(gòu)類(lèi)似于“鉸鏈”，因此，也稱(chēng)為HingeDNA，H-DNA。1957年Davis,Felsenfeld,Rich發(fā)現(xiàn)poly(U)+poly(U)+poly(A)T.SRNA

T.SDNA的概念1966年Miller&Sobell

實(shí)現(xiàn)RNA+D.SDNATriplepolyNt

但由于D.SDNA的提出而被忽視但因證明LacI產(chǎn)物為Repressor而被忽視asRepressor關(guān)閉基因

分子間的三股螺旋1987年Dervan.MoserScience238(645)合成S.SDNA+D.SDNA→T.SDNA

該種結(jié)構(gòu)主要發(fā)生DNA分子重組交換過(guò)程中RecA蛋白促使ssDNA與序列相似極性相同的同源dsDNA發(fā)生交換形成的三股螺旋（tsDNA）叫R-DNA平行三股螺旋

l

S.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA☆

Pu+Pu/Py(偏堿性介質(zhì)中穩(wěn)定)☆Py+Pu/Py(偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定)常見(jiàn)類(lèi)型

第三條鏈位于B-DNA的Majorgroove中與D.S.DNA一起旋轉(zhuǎn)T.S.DNA可能的功能

a)T.S.DNA可阻止調(diào)節(jié)蛋白與DNA結(jié)合,關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程

b)T.S.DNA與基因重組,交換有關(guān)

加入第三條S.S.DNA作為分子剪刀(molecularscissors),

定點(diǎn)切割DNA分子

d)加入反義的第三條鏈(anti-sencepolydNt)終止基因的表達(dá)

e)相反的觀點(diǎn)----T.S.DNA與基因表達(dá)呈正相關(guān)!?

④G－四股螺旋（Gtetraplex）多數(shù)真核生物細(xì)胞端粒3′端具有富含G的短重復(fù)序列形成四股螺旋，長(zhǎng)度常為12-16bp。G－四股螺旋（Gtetraplex）的Hoogsteen氫鍵配對(duì)G－四股螺旋（Gtetraplex）存在平行式和反平行式由單鏈形成的四股螺旋雙鏈四鏈3DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)－－DNAsupercoiling超螺旋DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤(pán)繞形成新的螺旋，常稱(chēng)為DNA超螺旋（DNAsupercoiling）將一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的鏈分離引起超螺旋當(dāng)DNA軸線(xiàn)沒(méi)有彎曲時(shí)的狀態(tài)稱(chēng)為松馳（relaxed）狀態(tài)松馳狀態(tài)松馳狀態(tài)超螺旋2道和3道是利用拓?fù)洚悩?gòu)酶處理的效果松馳狀態(tài)螺旋程度逐漸增加DNA超螺旋分為正超螺旋和負(fù)超螺旋正超螺旋由DNA雙螺旋過(guò)度纏繞引起。負(fù)超螺旋由DNA雙螺旋纏繞不足引起。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoisomerase）拓?fù)洚悩?gòu)酶I拓?fù)洚悩?gòu)酶II切斷DNA雙鏈中一股并再連接斷端，不需ATP供能使DNA雙鏈同時(shí)發(fā)生斷裂和再連接，需ATP供能。拓?fù)洚悩?gòu)酶I切斷DNA雙鏈中一股并再連接斷端拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ可催化超螺旋的形成拓?fù)洚悩?gòu)酶IIDNA雙鏈同時(shí)發(fā)生斷裂和再連接DNA超螺旋的生物學(xué)意義

DNA被壓縮和包裝，使其體積大大減小增加了DNA的穩(wěn)定性可能與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)4RNA的結(jié)構(gòu)與功能4.1RNA特點(diǎn)①堿基組成A、G、C、U（A＝U/G≡C，也有G＝U）不能配對(duì)區(qū)域形成突起稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解②多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成鏈內(nèi)螺旋③分子較小,一般含幾十至幾千個(gè)核苷酸主要的RNAmRNAtRNArRNA4.2tRNA占RNA總量的15％，一種氨基酸對(duì)應(yīng)最少一種RNA。分子量25000左右，大約由73－94個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾成分。3'-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)。功能：tRNA：轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，負(fù)責(zé)運(yùn)送氨基酸t(yī)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)“三葉草（cloverleaf）”結(jié)構(gòu)四環(huán)四莖四臂氨基酸臂：CCAD環(huán)：含D核苷（二氫尿嘧啶）反密碼子環(huán)：閱讀mRNA密碼，5′端總是“U”，3′端總嘌呤核苷殘基TΨC環(huán)：含假尿嘧啶（ψ），核糖體與tRNA結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn)額外環(huán)：區(qū)分不同tRNA的標(biāo)志tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)倒“L”結(jié)構(gòu)4.3rRNA原核生物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA

30s70s

50s16s5s、23s

40s80s

60s

18s5s、5.8s、28s占RNA總量的80％rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)也呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)大腸桿菌5SrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型rRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)4.4mRNA占細(xì)胞總RNA的3％～5％

3‘-末端有一段長(zhǎng)達(dá)200個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱(chēng)為“尾結(jié)構(gòu)”，5’-末端有一個(gè)甲基化的鳥(niǎo)苷酸，稱(chēng)為“帽結(jié)構(gòu)”。真核細(xì)胞mRNA5真核生物細(xì)胞DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)5.1真核生物染色體結(jié)構(gòu)層次①DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（2nm）④一環(huán)（突環(huán)，75000bp）②核小體組成的10nm“串珠”結(jié)構(gòu)③30nm纖絲⑤玫瑰花環(huán)（6個(gè)一環(huán)）⑥螺旋（超螺線(xiàn)管，30個(gè)玫瑰花環(huán)）⑦染色體（10個(gè)超螺線(xiàn)管）第四節(jié)核酸性質(zhì)1一般的理化性質(zhì)③兩性解離/一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），可用電泳或離子交換（色譜）進(jìn)行分離②線(xiàn)性大分子（粘度高?？辜羟辛Σ睿苁覝貤l件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解⑤加熱條件下，D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍(lán)紫色①微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑2核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線(xiàn)吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)。以A260/A280進(jìn)行定性、定量分析3變性（Denaturation）DNA分子中的雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈為無(wú)規(guī)則線(xiàn)性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象叫DNA變性DNA雙螺旋是緊密的剛性結(jié)構(gòu)，變性后轉(zhuǎn)化成柔軟而松散的無(wú)規(guī)則單股線(xiàn)性結(jié)構(gòu)，因此粘度明顯下降。①溶液粘度降低變性表征變性后整個(gè)DNA分子的對(duì)稱(chēng)性及分子構(gòu)型改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。②旋光性發(fā)生變化DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長(zhǎng)紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時(shí)DNA雙螺旋解開(kāi)，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。③紫外吸收增強(qiáng)增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)指DNA變性后其紫外吸收明顯增強(qiáng)的效應(yīng)。維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。導(dǎo)致DNA變性的因素加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，DNA變性的本質(zhì)

DNA的變性過(guò)程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時(shí)的溫度稱(chēng)熔解溫度，用Tm表示。①DNA的均一性DNA的均一性DNA分子組成均一性Poly(A-T)P