第九章 核酸與蛋白質的生物合成

第九章核酸與蛋白質的生物合成本章主要內容：DNA的生物合成

RNA的生物合成DNA的生物合成

現(xiàn)代生物化學和分子生物學的一個最基本的觀點——在生命有機體中，基因是唯一能夠復制，并且能永遠存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質才體現(xiàn)出來。從DNA到蛋白質，遺傳信息的流動遵循著中心法則。中心法則第一節(jié)DNA的生物合成（一）DNA的復制方式——半保留復制

（semiconservativereplication）即新的雙鏈DNA中，一股鏈來自模板，一股鏈為新合成的。

半保留復制的意義復制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性。一、DNA的復制半保留復制實驗依據1958年M.Messelson等用實驗加以證實

雙螺旋結構是半保留復制的分子基礎

（二）DNA復制的起始點和方向

DNA復制都是起始于一個特定的位點，稱為起點。細胞中基因組DNA具有復制起點并能獨立進行復制的單位稱為復制子。原核生物只有一個復制起始點，是單復制子。真核生物有多個起始點，是多復制子。在起點處DNA雙螺旋的兩條鏈分開，DNA分別以兩條鏈為模板復制新的DNA，在復制的部分同時進行解鏈與合成，結果形成一個分叉，稱為復制叉或生長點。大多數(shù)DNA從起始點向兩側復制，即有兩個復制叉，也有一些復制是單向的，只形成一個復制叉。

（以原核生物大腸桿菌為例）原料：dNTP，Mg++模板：雙鏈DNA模板引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3’OH。（三）參與DNA復制的酶類和蛋白因子1.拓撲異構酶和解旋酶

拓撲一詞的含義是指物體或圖象做彈性移位而又保持物體不變的性質。DNA分子中存在打結，纏繞、連環(huán)的現(xiàn)象。I型酶：切開雙鏈中的一股，使DNA不致打結，切口的3’端可通過自由轉動一周再與5’端磷酸連接，不需ATP。II型酶：切斷處于超螺旋狀態(tài)中雙股鏈中的某個部位，通過切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢復復制所要求的負超螺旋狀態(tài)。解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復制的起始點（OriC）上解開雙螺旋。2.單鏈結合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）穩(wěn)定已經解開成兩股的DNA單鏈，防止其退火復性。3.DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III主要的復制酶，并有校讀、糾錯的功能5’——3’延伸多核苷酸鏈，活性很強,有模板依賴性，其延伸的方式是依據堿基互補配對的原則，將原料dNTP與游離的3’OH上連接，同時釋出一個PPi

。3’——5’外切酶切除可能錯配的核苷酸聚合酶I用于切除引物RNA,并填補留下的空隙

5’——3’延伸多核苷酸鏈,3’——5’外切酶的作用，切除可能錯配的核苷酸5’——3’外切酶的作用是切除引物聚合酶II活性弱5’——3’延伸多核苷酸鏈

3’——5’外切酶DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈總是5’3’聚合酶催化的鏈延長反應

真核的DNA聚合酶

真核DNA的復制至少涉及5種復制酶，其中α、δ、ε參與染色體DNA的復制，α有引物要求；β負責DNA的修復；γ的功能是線粒體DNA的復制。

5.DNA連接酶（ligase）

將不連續(xù)的DNA片段以磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP4.引物酶（primase，DnaG），用于合成復制所必需的RNA引物。

復制的起始在原核生物只有一個起始點（OriC），而在真核生物有多個起始點。

在DNA復制時，首先由解鏈蛋白酶識別并結合到復制起始點，使DNA雙螺旋局部解鏈形成復制叉。單鏈DNA結合蛋白集合到分開的單鏈上，使其處于穩(wěn)定的解鏈狀態(tài)。引物酶以解開的單鏈的一段為DNA模板，以脫氧核苷三磷酸為底物，按5’→3’方向合成一個短鏈RNA引物，此引物3’-OH末端為新合成的DNA的起點。（四）DNA的復制過程復制的起始復制起始點原核真核復制叉

原核生物復制的起始

這個過程由DNA聚合酶III催化，它是主要的復制酶。領頭鏈（leadingchain）：為連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致，它的模板DNA鏈是5’——3’鏈。滯后鏈（laggingchain）：不連續(xù)合成，在RNA引物基礎上分段合成DNA小片段（岡崎片段），方向與解鏈方向相反，它的模板DNA鏈是3’——5’鏈。

由此可見，整個DNA分子的復制是半不連續(xù)的。多肽鏈的延伸半不連續(xù)復制示意圖

復制叉上各種酶與蛋白因子的作用和作用部位復制叉的結構復制的終止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來。復制的全過程DNA復制過程胸腺嘧啶二聚體

DNA的突變(損傷)大多數(shù)是自發(fā)的，是進化與分化的基礎。環(huán)境中的理化因素，如紫外輻射引起兩個嘧啶堿基的共價聚合。許多化學誘變劑，它們常是致癌物,如亞硝酸鹽，常導致DNA突變。DNA的突變有點突變（堿基的錯配）、堿基的缺失、DNA片段的重排等形式。二、DNA的損傷和修復（一）DNA的損傷直接修復：如光復活酶,普遍存在在生物機體中,可以把嘧啶二聚體恢復正常狀態(tài)。切除修復：找出損傷位置并切除，進行修復合成并連接。重組修復：先復制再修復。子代鏈在對應模板鏈的損傷處留下缺口，先將同源母鏈DNA上相應的核苷酸片段轉移替補，然后再合成一段序列填充缺口。SOS系統(tǒng)：復雜的應急反應。既有避免差錯的修復又有引起差錯的修復，后者有高變異率但也增加了生存機會。（二）DNA的修復切除修復重組修復逆轉錄也稱反轉錄，是某些生物（如雞的肉瘤病毒、HIV等）的特殊復制方式。它們的遺傳信息載體是RNA而不是DNA。因此，在感染細胞時，首先經過逆轉錄作用成為雙鏈DNA，才能整合到宿主基因組中去。這個過程由逆轉錄酶催化，它具有以RNA為模板合成DNA，水解雜交鏈上的RNA以及以DNA為模板合成DNA三種活性。逆轉錄現(xiàn)象和逆轉錄酶（reversetranscriptase）（H.Temin，1970）是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)，是對經典中心法則重要補充。三、RNA指導下的DNA合成反轉錄過程

一、轉錄（transcription）：以DNA為模板，在RNA聚合酶（RNApolymerase）的作用下合成mRNA，將遺傳信息從DNA分子上轉移到mRNA分子上，這一過程稱為轉錄（transcription）。

第二節(jié)RNA的生物合成（一）轉錄的特點轉錄是以DNA為模板合成RNA,并且只是以單股DNA為模板，因此具有不對稱性；用以轉錄的單鏈DNA,稱為模板鏈,與復制不同，轉錄是局部的,從啟動子開始到終止子結束,為一個轉錄單位;RNA合成的方向為5'→3'；轉錄不需要引物；RNA的生物合成是一個酶促反應過程；轉錄首先得到RNA前體，然后再進行加工轉變?yōu)槌墒斓腞NA.被轉錄成單個RNA分子的一段DNA稱為一個轉錄單位(transcript)分子量48萬，5種亞基：

全酶=核心酶（α2ββ’）+σ因子

α亞基決定轉錄的基因β亞基在5’——3’方向上延長多核苷酸鏈，其方式與DNA聚合酶相同，原料為NTP，沒有糾錯的功能。β’亞基結合DNA模板

σ因子識別啟動子并與之結合（二）RNA聚合酶（RNApolymerase）1.原核的RNA聚合酶聚合酶I：轉錄45SrRNA聚合酶II：轉錄mRNA的前體，稱為核不均RNA（hnRNA）聚合酶III：轉錄tRNA和5SrRNA等2.真核的RNA聚合酶（三）轉錄的過程1.轉錄的起始

啟動子：DNA分子中可以與RNA聚合酶特異結合的部位。一般包括RNA聚合酶的識別位點、結合位點、轉錄起始位點。大腸桿菌的RNA聚合酶與DNA模板鏈結合分三步：

①RNA聚合酶的σ因子辨認啟動子的識別位點；②酶與啟動子以“關閉”復合體的形式即雙螺旋形式結合；③RNA聚合酶覆蓋的部分DNA雙鏈打開形成轉錄空泡，進入轉錄起始位點，開始合成RNA。

轉錄起始不需引物，第一個核苷酸總是GTP或ATP，GTP更常見。轉錄空泡不是RNA聚合酶覆蓋的全部DNA雙鏈解開，只是由覆蓋酶的部分雙鏈解開。合成RNA的第一個核苷酸和進入的第二個核苷酸在RNA聚合酶的催化下形成3′,5′-磷酸二酯鍵，第一個核苷酸保留NTP狀態(tài)，進入的第二個核苷酸末端有游離羥基，可供后面加入NTP延長RNA鏈。常把“RNA聚合酶全酶—DNA模板—NTPNMP—OH”稱為轉錄起始復合物，起始復合物的形成標志起始的結束。

2.RNA鏈的延伸

由核心酶催化，以其中的一股DNA單鏈作為模板鏈，以NTP為原料，按照堿基互補配對的原則，通常是由5’ppp嘌呤核苷（G或A）開頭向著3’延長多核苷酸鏈，合成開始后，σ因子從模板上脫離下來（可以重復利用）。核心酶覆蓋雙鏈DNA和RNA復合物，向前推進，一邊解開螺旋，一邊釋放出新合成的RNA鏈，后面已經轉錄的區(qū)域中分開的DNA鏈又重新形成雙螺旋。“轉錄泡（transcriptionbubble）”轉錄過程中的模板識別、起始和延伸

A.依賴ρ因子的終止

新生RNA上有ρ因子的識別位點。它與聚合酶-DNA-RNA復合物結合，向3’端移動，并解開DNA-RNA雜交體，需ATP。B.依賴于特定序列的終止

轉錄終止區(qū)有特殊結構。終止區(qū)的上游有GC二重對稱區(qū)，轉錄的RNA容易形成多個“發(fā)卡”結構,轉錄產物的3’端有polyU序列。這種特殊的二級結構阻止了轉錄向下游繼續(xù)推進。

3.轉錄的終止AB轉錄的全過程

轉錄得到的只是初級產物，通常要經過加工，才能轉變?yōu)槌墒斓腞NA。tRNA和rRNA的轉錄后加工比較簡單，而mRNA的轉錄后加工比較復雜。原核基因是多順反子（poly-cistron），通常是幾個相關的結構基因（編碼的）同時轉錄得到多個mRNA。而真核基因是單順反子（mono-cistron），又是斷裂基因。其結構基因中由編碼的外顯子（exon）和不編碼的內含子（intron）間隔排開。轉錄得到的是“毛坯”，要在其5’端加上鳥嘌呤“帽子”，3’端加上polyA的“尾巴”，切除內含子，拼接外顯子，才能成為一個成熟的mRNA。三、RNA的轉錄后加工原核前體RNA的加工tRNA轉錄后的加工與修飾注意稀有堿基真核rRNA前體轉錄后的加工真核mRNA前體轉錄后加工(以卵清蛋白mRNA的轉錄為例)外顯子內含子mRNA的剪切首、尾部的修飾1）5‘端形成帽子結構（m7GpppGp-）2）3‘端加上多聚腺苷酸尾巴（polyAtail）真核生物mRNA的轉錄后加工帽子結構三、RNA的復制噬菌體Qβ的RNA復制兩階段（1）其單鏈RNA可充當mRNA，利用寄主中的核糖體合成外殼蛋白和RNA復制酶的β亞基。（2）復制酶的β亞基可與來自寄主細胞的亞基αδ自動裝配成RNA復制酶，可進行RNA的復制，以分子中單鏈RNA為模板（正鏈），復制出一條新的RNA鏈（負鏈），再復制出正鏈，與外殼蛋白組裝成新的噬菌體顆粒。某些RNA病毒可以以自身RNA為模板進行復制。不同的RNA病毒復制方式不同5RNA-533RNA+釋放釋放353355RNA+RNA+RNA-RNA-及

RNA+的合成方向均為5‘3’復制和轉錄的異同點相同點：1.都以DNA為模板2.原料為核苷酸3.合成方向均為5′→3′方向4.都需要依賴DNA的聚合酶5.遵守堿基互補配對規(guī)律6.產物為多聚核苷酸鏈

不同點：

復制

轉錄

模板兩股鏈均作為模板

模板鏈作為模板

原料

dNTP

NTP

聚合酶

DNA聚合酶

RNA聚合酶

產物

子代DNA雙鏈

mRNA;tRNA;rRNA

配對

A-T；G-C

A-U；T-A；G-C★

引物

需RNA引物--------

★方式(特點)

半保留復制不對稱轉錄原料氨基酸，20種mRNA是合成蛋白質的“藍圖（或模板）”tRNA是原料氨基酸的“搬運工”rRNA與多種蛋白質結合成核糖體作為合成多肽鏈的裝配機（操作臺）第三節(jié)蛋白質的生物合成

在細胞中，以mRNA為“模板”、在核糖體、tRNA和多種蛋白因子的共同作用下，將mRNA分子的核苷酸序列轉變?yōu)榘被嵝蛄械倪^程稱為翻譯。轉錄和翻譯統(tǒng)稱為基因表達。蛋白質翻譯系統(tǒng)示意圖

mRNA是遺傳信息的載體（載有遺傳密碼，geneticcode），是合成蛋白質的藍圖（模板），它以一系列三聯(lián)體密碼子（codon）的形式從DNA轉錄了遺傳信息。每個密碼子代表一個氨基酸。mRNA占細胞總RNA的5-10%，不穩(wěn)定，壽命短。原核的mRNA是多順反子;真核的mRNA是單順反子。（一）mRNA與遺傳密碼一、RNA在蛋白質生物合成中的作用1.mRNA

2.遺傳密碼

上世紀60年代，利用均聚核苷酸實驗，破譯了遺傳密碼。遺傳密碼為三聯(lián)體（每三個堿基代表一個氨基酸），由5’到3’閱讀，無間斷。即使在少數(shù)重疊基因（如病毒）中，其開放閱讀框架（readingframe）仍按此原則。

4種核苷酸可組成64種密碼，其中61中分別代表不同氨基酸，而蛋氨酸的密碼AUG，又可作為肽鏈合成的起始密碼。還有3種密碼UAA、UAG、UGA不代表任何氨基酸，是肽鏈合成的終止密碼。遺傳密碼表遺傳密碼的特點1.連續(xù)性：密碼是連續(xù)排列的，密碼子之間沒有任何標點加以隔開。2.簡并性：除蛋氨酸和色氨酸外，其余18種氨基酸的密碼均在2種或2種以上。3.擺動性：4.通用性：生物界所有的物種都通用這套遺傳密碼5.有起始密碼(AUG)和終止密碼(UAG,UAA,UGA)原核tRNA有30-40種，真核有50-60種，含70-90個核苷酸，并有多種稀有堿基。tRNA是最小的RNA，占細胞總RNA的15%左右，其功能是搬運氨基酸和解讀密碼子。tRNA具有“四環(huán)一臂”和“三葉草”形的典型結構。注意：3’端CCA氨基酸受位和反密碼子環(huán)（二）tRNA的作用tRNA的結構—“四環(huán)一臂”倒L形的三級結構

tRNA的功能是解讀mRNA上的密碼子和搬運氨基酸

tRNA上至少有4個位點與多肽鏈合成有關：即3’CCA氨基酸接受位點、氨基酰-tRNA合成酶識別位點、核糖體識別位點和反密碼子位點。

每一個氨基酸有其自身的tRNA。氨基酸的羧基與tRNA的3’CCA-OH以酯鍵結合。氨基酸與mRNA相應的密碼子正確“對號”須依賴于tRNA的反密碼子。

密碼子與反密碼子的配對方式變偶性——反密碼子5’端的堿基與密碼子的第三位配對不嚴格

核糖體是rRNA與幾十種蛋白質的復合體，有大、小兩個亞基構成。含有合成蛋白質多肽鏈所必需的酶、起始因子（IF）、延伸因子（EF）、釋放因子（RF）等。

原核的核糖體（70S）=30S小亞基+50S大亞基其中30S小亞基含16SrRNA和21種蛋白質50S大亞基含23S，5SrRNA和34種蛋白質

真核的核糖體（80S）=40S小亞基+60S大亞基其中40S小亞基含18SrRNA和33種蛋白質60S大亞基含28S，5.8S，5SrRNA和45種蛋白質（三）rRNA與核糖體（ribosome）

核糖體有4個基本功能1.容納mRNA，并能沿著mRNA由5’——3’移動，由tRNA解讀其密碼；2.氨基酰位點（A位點），可結合氨基酰-tRNA（AA-tRNA）；3.肽?；稽c（P位點），可結合肽?；?tRNA（肽-tRNA）；4.肽?；D移酶中心，是形成肽鍵的位點等。

所有參與合成多肽鏈的氨基酸都要激活，并由數(shù)十種高度專一的氨基酰-tRNA合成酶催化。該酶由兩個識別位點，它們能識別特定的氨基酸和選擇其所對應的tRNA，使兩者連接起來（利用ATP）。反應如下：

氨基酸的羧基與tRNA的3’端CCA-OH以酯鍵相連，因此其氨基是自由的。二、蛋白質的生物合成過程（一）氨基酸的活化氨基酸與tRNA的連接方式

翻譯起始時，第一個氨基酸一般是蛋氨酸，其氨基要甲?；?，予以保護。甲酰FH4甲酰基MettRNAfmetfMet-tRNA合成酶fMet-tRNA酯鍵首先IF3、IF1幫助30S小亞基與mRNA結合，IF2和GTP幫助甲酰甲硫氨酸-tRNA與AUG配對，接著IF3脫離，形成30S起始復合物。50S大亞基進入，IF1和IF2脫離，形成50S起始復合物，需要GTP。甲酰甲硫氨酸-tRNA處于P位。（二）肽鏈合成的起始（三）肽鏈的延伸（注意新的AA-tRNA如何定位，第一個肽鍵如何形成，核糖體如何移動…）