化學(xué)生物學(xué)第六章 化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用

第六章化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用

Chapter6.Interactionsbetweenchemicalsandproteins

第八次課在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)（包括酶）占細(xì)胞干重的70%以上，種類繁多，在生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著各種各樣的作用。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和生活質(zhì)量要求的提高，蛋白質(zhì)在食品、醫(yī)藥（生化藥物、臨床檢驗(yàn)、藥物篩選等）、環(huán)保（環(huán)境分析）、農(nóng)業(yè)、日用化工（化妝品）、精細(xì)化工（酶催化合成）等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛。在蛋白質(zhì)體外的應(yīng)用中，一般涉及到分離純化、儲(chǔ)存、含量檢測等過程，其中常常發(fā)生化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)非專一性的相互作用，如沉淀作用、變性作用、穩(wěn)定作用以及化學(xué)修飾作用等。

第一節(jié)概述球狀蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要特征絕大多數(shù)蛋白質(zhì)折疊成為近乎球狀的結(jié)構(gòu)。球狀蛋白質(zhì)一旦具有三級(jí)結(jié)構(gòu)后，蛋白質(zhì)內(nèi)部變得更為緊密，內(nèi)部的空間約有75％被原子所充滿。這樣的密集程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過在液體中的小分子，可以與某些晶體相比。蛋白質(zhì)可認(rèn)為是帶有極性外套的油滴，也就是“非極性在內(nèi)，極性在外”。大量蛋白質(zhì)的X射線晶體衍射分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果充分證明了這一規(guī)律。存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部的主要是一些非極性殘基側(cè)鏈，約有63％是丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等；帶電的殘基，如天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸只有4％。約95％的帶電側(cè)鏈分布在蛋白質(zhì)表面；約14％的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸在蛋白質(zhì)分子表面。蛋白質(zhì)內(nèi)部存在極少量的親水殘基，表面也常見到一些疏水殘基。這些“異?！狈植嫉臍埢?，致使肽鏈的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生“扭曲”，一些鍵的張角與一般正常的值有偏離，蛋白質(zhì)中這些局部的構(gòu)象具有相對(duì)偏高的能量，相對(duì)處于較不穩(wěn)定狀態(tài)，在外界很小的擾動(dòng)作用下，就能發(fā)生變化。原則上，一些相對(duì)規(guī)則的-螺旋和-折疊分布在球狀蛋白內(nèi)部，且壓積得很緊密，致使球狀蛋白具有致密的結(jié)構(gòu)；那些-螺旋和-折疊疊規(guī)整性相對(duì)差一些的二級(jí)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)角和環(huán)狀以及特定的“無規(guī)”卷曲，則更多地分布在球狀蛋白外周。值得指出的是在很多蛋白質(zhì)分子內(nèi)部還存在著數(shù)量不同的水分子，這些水分子也和一些極性基因或負(fù)電性原子形成氫鍵。其中一些也參與蛋白質(zhì)功能的行使過程。球狀蛋白表面并不是非常光滑的，而是具有很多溝渠，多數(shù)球狀蛋白可及表面的面積約為同樣大小球表面積的兩倍。

球狀蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)具有高度特異性和高度靈敏性。每種蛋白質(zhì)分子都有特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)象特異性，使它區(qū)別于其他蛋白質(zhì)；但這種高度特異性結(jié)構(gòu)，并非固定不變，在執(zhí)行生物學(xué)功能時(shí)，常常發(fā)生一系列的構(gòu)象變化，表現(xiàn)出高度靈敏性。在生物體內(nèi)，構(gòu)象變化，往往是該蛋白質(zhì)分子與配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受體的小分子激素和神經(jīng)介質(zhì)、血紅蛋白O2等。因此，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)總是處于一種可以相互轉(zhuǎn)變的多種構(gòu)象平衡態(tài)。球狀蛋白質(zhì)分子表面并不光滑，常出現(xiàn)一些“裂隙”或“洞穴”，“裂隙”或“洞穴’’周圍常具有疏水性，這些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白質(zhì)(酶)的活性部位。硫氧還蛋白的結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合水親水性殘基疏水性殘基第二節(jié)

化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用

由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉淀作用。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。

沉淀作用的類型可逆沉淀不可逆沉淀抗體-抗原沉淀在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。蛋白質(zhì)在沉淀過程中結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，又稱為非變性沉淀。在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，又稱為變性沉淀。抗體和抗原蛋白通過相互識(shí)別和結(jié)合而發(fā)生的沉淀現(xiàn)象。這種特殊的沉淀作用是生物體免疫功能的基礎(chǔ)。一、無機(jī)物沉淀當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中逐漸加入無機(jī)鹽時(shí)，開始蛋白質(zhì)的溶解度增大，是由于蛋白質(zhì)的活度系數(shù)降低的緣故，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當(dāng)繼續(xù)加入電解質(zhì)時(shí)，另一種因素起作用，使蛋白質(zhì)的溶解度減小，稱為鹽析。這是由于電解質(zhì)的離子在水中發(fā)生水化，當(dāng)電解質(zhì)的濃度增加時(shí)，水分子就離開蛋白質(zhì)的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，疏水區(qū)域越多，就越易產(chǎn)生沉淀。（1）鹽析牢固結(jié)合水大量溶劑水層含高價(jià)陰離子的鹽，效果比1價(jià)的鹽好。陰離子的鹽析效果有下列次序：檸檬酸鹽>PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-。但高價(jià)陽離子的效果不如低價(jià)陽離子，例如硫酸鎂的效果不如硫酸銨。對(duì)于1價(jià)陽離子則有下列次序：NH4+＞K+＞Na+。

因此，最常用的鹽析劑是硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。但硫酸鈉在40C以下溶解度較低，因而僅適用于對(duì)熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。磷酸鹽在中性范圍內(nèi)實(shí)際上是HPO42-和H2PO4-的混合物，其作用比PO43-差。硫酸銨由于價(jià)廉、溶解度大，且能使蛋白質(zhì)穩(wěn)定,在2-3mol/L(NH4)2SO4中酶可保存幾年。同時(shí)由于鹽的濃度高，可防止蛋白酶和細(xì)菌作用，故是最常用的鹽析劑。硫酸銨的缺點(diǎn)是水解后變酸，在高pH下會(huì)釋放出氨，腐蝕性強(qiáng)；殘留的硫酸銨在食品中雖然量少，也會(huì)影響其味，在醫(yī)療上有毒，因此必須除去。（2）金屬離子沉淀法一些高價(jià)金屬離子對(duì)沉淀蛋白質(zhì)很有效。它們可以分為三類：第一類為Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等側(cè)鏈結(jié)合。第二類為Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基結(jié)合，但不和含氮化合物相結(jié)合。第三類為Ag+，Hg2+和Pb2+能和蛋白質(zhì)分子表面的巰基相結(jié)合。金屬離子沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)谙∪芤褐袑?duì)蛋白質(zhì)有效強(qiáng)的沉淀能力。處理后殘余的金屬離子可用離子交換樹脂或螯合劑除去。在這些離子中，應(yīng)用較廣的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和Mn2+，而Cu2+，F(xiàn)e2+，Pb2+，Hg2+等較少應(yīng)用，因?yàn)樗鼈儠?huì)使產(chǎn)品損失和引起污染。如Zn2+可用于沉淀?xiàng)U菌肽(作用于第4個(gè)組氨酸殘基上)和胰島素；Ca2+(CaCO3)用于分離乳酸，血清清蛋白等。二、等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動(dòng)。等電點(diǎn)沉淀法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在偏酸性范圍內(nèi)，而無機(jī)酸通常價(jià)較廉，并且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應(yīng)用能為蛋白質(zhì)類食品所允許。同時(shí)，常可直接進(jìn)行其他純化操作，無需將殘余的酸除去。等電點(diǎn)沉淀法的最主要缺點(diǎn)是酸化時(shí)，易使蛋白質(zhì)失活，這是由于蛋白質(zhì)對(duì)低pH比較敏感。pH對(duì)-乳球蛋白溶解度的影響

三、有機(jī)物沉淀利用和水互溶的有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)沉淀的方法很早就用來純化蛋白質(zhì)。加入有機(jī)溶劑于蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來使蛋白質(zhì)沉淀。其中主要效應(yīng)是水活度的降低。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對(duì)蛋白質(zhì)分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。在疏水區(qū)域附近近有序排列的水分子可以為有機(jī)溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了疏水性特別強(qiáng)的蛋白質(zhì)外，對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)來說，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。

1.有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是溶劑容易蒸發(fā)除去，不會(huì)殘留在成品中，因此適用于制備食品蛋白質(zhì)。而且有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)是容易使蛋白質(zhì)變性失活，且有機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。一般所選擇的溶劑必須能和水互溶，而和蛋白質(zhì)不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，最常用的溶劑是乙醇和丙酮，加量在20-50%（V/V）之間。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的溶液pH接近等電點(diǎn)時(shí)，引起沉淀所需加入有機(jī)溶劑的量較少。

2.酚類化合物及有機(jī)酸沉淀當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶有正電荷，容易與酚類化合物或有機(jī)酸酸根所帶的負(fù)電荷發(fā)生作用生成不溶性鹽而沉淀。這類化合物包括鞣酸（又稱單寧）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水楊酸等。單寧是一種多酚類化合物的寡聚體，它們的酚羥基可以解離而帶有負(fù)電荷，而且分子中的苯環(huán)、多個(gè)羥基可以與蛋白質(zhì)發(fā)生非共價(jià)相互作用，結(jié)合在蛋白質(zhì)的表面，然后在蛋白質(zhì)分子之間形成多點(diǎn)交連而成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致聚集而沉淀

四、聚合物沉淀許多非離子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用來進(jìn)行選擇性沉淀以純化蛋白質(zhì)。聚合物的作用認(rèn)為與有機(jī)溶劑相似，能降低水化度，使蛋白質(zhì)沉淀。此現(xiàn)象和雙水相的形成有聯(lián)系。若使低分子量的蛋白質(zhì)沉淀，需加入大量PEG；而使高分子量的蛋白質(zhì)沉淀，加入的量較小。PEG是一種特別有用的沉淀劑，因?yàn)闊o毒，不可燃性且對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用而被廣泛使用。一般PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20000。所用的PEG濃度通常為20%，濃度再高，會(huì)使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。PEG對(duì)后繼分離步驟影響較少，因此可以不必除去。1.非離子型聚合物沉淀法2.聚電解質(zhì)沉淀法

有一些離子型多糖化合物可應(yīng)用于沉淀食品蛋白質(zhì)。如羧甲基纖維素，海藻酸鹽，果膠酸鹽和卡拉膠等。它們的作用主要是靜電引力。如羧甲基纖維素能在pH值低于等電點(diǎn)時(shí)使蛋白質(zhì)沉淀。但加入量不能太多，否則會(huì)引起膠溶作用而重新溶解。一些陰離子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些陽離子聚合物如聚乙烯亞胺和以聚苯乙烯為骨架的季胺鹽也曾用來沉淀乳清蛋白質(zhì)。聚丙烯酸能在pH8.8時(shí)沉淀90%以上的蛋白質(zhì)，聚苯乙烯季胺鹽能在pH10.4時(shí)沉淀95%的蛋白質(zhì)。聚乙烯亞胺能與蛋白質(zhì)的酸性區(qū)域形成復(fù)合物，在中性時(shí)帶正電，可在污水處理中作絮凝劑，也廣泛用于酶的純化中。第三節(jié)化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用

許多蛋白質(zhì)在一般緩沖溶液中的穩(wěn)定性相當(dāng)?shù)?，某些酶蛋白溶液?7C放置的半衰期僅幾個(gè)小時(shí)。這種穩(wěn)定性降低的原因常常是某些物理或化學(xué)因素破壞了維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的天然狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。

一、蛋白質(zhì)不可逆失活的化學(xué)因素1.強(qiáng)酸和強(qiáng)堿強(qiáng)的無機(jī)酸堿及有機(jī)酸堿都可以改變蛋白質(zhì)溶液的pH，引起蛋白質(zhì)表面必需基團(tuán)的電離，由于各氨基酸殘基所帶電荷的相互吸引或排斥使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，造成蛋白質(zhì)分子聚集，導(dǎo)致不可逆失活。另外，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下，肽鍵也容易被水解斷裂，天冬酰胺和谷酰胺側(cè)鏈的酰胺會(huì)發(fā)生脫氨作用，改變了原來蛋白質(zhì)表面的電荷分布，使蛋白質(zhì)構(gòu)象重新排布，結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去活性。2.氧化劑各種氧化劑能夠氧化芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。其中酪氨酸側(cè)鏈的酚羥基可以被氧化成醌，后者可以與蛋白質(zhì)表面的巰基、氨基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成交聯(lián)產(chǎn)物。在堿性條件下，半胱氨酸可以被Cu2+氧化成次磺酸或亞磺酸或磺酸半胱氨酸。分子氧、H2O2以及過氧化物（如過氧甲酸）、氧自由基等是最常見的氧化劑，在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的氧化失活主要是通過活性氧（羥基自由基、超氧離子、過氧化氫、過氧化物）來完成的。這些氧化劑的殺菌作用主要也是造成蛋白質(zhì)失活。3.去污劑和表面活性劑去污劑一般分為離子型和非離子型兩大類，都具有長鏈?zhǔn)杷埠陀H水的極性頭。當(dāng)少量的陰離子去污劑（如十二烷基磺酸鈉，SDS）單體加入到蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，去污劑與蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域結(jié)合，隨著加入量增加，與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，這時(shí)去污劑則以協(xié)同方式結(jié)合于蛋白質(zhì)其它位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展，分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露，并進(jìn)一步與去污劑結(jié)合，直到達(dá)到飽和為止，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。4.變性劑高濃度脲（8-10mol/L）和鹽酸胍（6mol/L）常常用于蛋白質(zhì)變性和復(fù)性研究，由于脲或鹽酸胍與蛋白質(zhì)多肽鏈作用，破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵，引起蛋白質(zhì)不可逆失活。

（1）脲和鹽酸胍（2）有機(jī)溶劑水互溶有機(jī)溶劑可以使酶、蛋白質(zhì)失去活性，是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑取代了蛋白質(zhì)表面的結(jié)合水，并通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，改變了溶液的介電常數(shù)，從而影響維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的非共價(jià)力的平衡。（3）螯合劑結(jié)合金屬離子的試劑，如EDTA等可以使金屬酶、金屬蛋白失活，這是因?yàn)镋DTA與金屬離子形成配位復(fù)合物，從而使酶失去金屬輔助因子造成的。失去金屬輔助因子的酶或蛋白質(zhì)可以引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生較大改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活力不可逆的喪失。但是，螯合劑可以螯合對(duì)蛋白質(zhì)有害的金屬離子，使那些不需要金屬離子的蛋白質(zhì)穩(wěn)定。

5.重金屬離子和巰基試劑在金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用中，一些重金屬離子，如Hg2+、Cd2+、Pb2+能與蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反應(yīng)，使蛋白質(zhì)不可逆沉淀而變性失活。巰基試劑，如巰基乙醇等通過還原蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵而使蛋白質(zhì)失去活性，但這個(gè)過程一般是可逆的。而低分子量的含二硫鍵的試劑可與蛋白質(zhì)中的巰基作用，形成混合二硫鍵，造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致其失活。

LysArg水蛋白質(zhì)不可逆失活的化學(xué)因素

強(qiáng)酸和強(qiáng)堿

強(qiáng)的酸堿可以改變蛋白質(zhì)溶液的pH引起蛋白質(zhì)表面必需基團(tuán)的電離，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成蛋白質(zhì)分子聚集，導(dǎo)致變性。

氧化劑

氧化劑甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。酪氨酸側(cè)鏈的酚羥基可以被氧化成醌再與巰基、氨基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成交聯(lián)產(chǎn)物。

表面活性劑變性劑

重金屬離子去污劑與蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展，分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。

脲或鹽酸胍與蛋白質(zhì)多肽鏈作用，破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵。有機(jī)溶劑也會(huì)引起蛋白質(zhì)變性失活Hg2+、Cd2+、Pb2+能與蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反應(yīng)，使蛋白質(zhì)不可逆沉淀而變性失活。

二、化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響，保持其生物活性的能力。根據(jù)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)等存在的狀態(tài)，可以利用化學(xué)物質(zhì)或化學(xué)方法使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化，以有利于蛋白質(zhì)在體外的應(yīng)用。通過研究蛋白質(zhì)的變性及穩(wěn)定性，可以了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能與穩(wěn)定性的關(guān)系等。在蛋白質(zhì)（酶）分離、純化、儲(chǔ)藏和應(yīng)用中，可以通過化學(xué)方法使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。常用的方法有：固定化：將酶或蛋白質(zhì)多點(diǎn)連接于載體上（無機(jī)載體、高分子載體）；添加劑：保護(hù)蛋白質(zhì)（酶）不受氧化劑氧化、不受變性劑變性等；化學(xué)修飾：共價(jià)交聯(lián)，使蛋白質(zhì)構(gòu)象固化。

穩(wěn)定劑共溶劑

糖類，醇氨基酸及其衍生物無機(jī)鹽，甘油，聚乙二醇等常用1-4M濃度共溶劑來穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞器?？寡趸瘎?/p>

底物、輔酶金屬離子

化學(xué)交聯(lián)劑半胱氨酸，2-巰基乙醇還原谷胱甘肽，二巰基赤蘚醇等巰基試劑可防止巰基氧化植物抗氧化劑如兒茶酚黃酮等也具有保護(hù)作用酶可被底物輔酶、競爭性抑制劑及反應(yīng)產(chǎn)物等所穩(wěn)定。金屬離子不僅可以影響酶的活性，還可以影響酶的穩(wěn)定性如Ca2+多位點(diǎn)結(jié)合使得蛋白質(zhì)分子成為緊密的活性形式。交聯(lián)劑可在相隔較近的兩個(gè)氨基酸殘基之間，或蛋白質(zhì)與其他分子之間（如固定化載體）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)使蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定。三、化學(xué)物質(zhì)的共價(jià)修飾作用

化學(xué)物質(zhì)與生物大分子的共價(jià)作用常常涉及到物質(zhì)的生理活性（包括藥理、毒理等），如何判斷化合物與蛋白質(zhì)分子中的哪類基團(tuán)作用，在體外主要用化合修飾的方法。該方法是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的一種重要的基礎(chǔ)手段。1.生物體內(nèi)蛋白質(zhì)加合物的形成

許多化學(xué)毒物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害與其親電代謝產(chǎn)物同細(xì)胞大分子的親核部位(如蛋白質(zhì)的巰基)發(fā)生不可逆結(jié)合具有密切關(guān)系。當(dāng)外源化合物的活性代謝產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)重要生物大分子，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等共價(jià)結(jié)合，發(fā)生烷基化或芳基化，即導(dǎo)致DNA損傷、蛋白質(zhì)正常功能喪失，乃至細(xì)胞的損傷或死亡、外源化合物與生物大分子相互作用主要有兩種方式：非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合。

(1)可與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的化合物

除少數(shù)烷化劑外，絕大多數(shù)外源化合物需經(jīng)體內(nèi)代謝活化，轉(zhuǎn)變成親電子的活性代謝物，再與細(xì)胞內(nèi)生物大分子中的親核部位和基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，例如蛋白質(zhì)分子中的親核基團(tuán)、DNA、RNA及一些小分子物質(zhì)如谷胱甘肽等的親核部位等。

(2)蛋白質(zhì)分子中的可反應(yīng)基團(tuán)

致癌物分子量的大小不同，反應(yīng)是不同的，分子量較小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的環(huán)氧化物、丙烯酰胺等，與蛋白質(zhì)作用時(shí)，所形成的加合物依賴于外源化合物與各種氨基酸反應(yīng)的相對(duì)速率。

試劑類型化合物或前體反應(yīng)機(jī)制烷基化芳香基化鹵代物親核取代環(huán)氧化物硫酸烷基酯活潑的烯烴1,4-加成羰基化合物醛形成希夫堿酰基化有機(jī)酸酐、酰氯等親核取代或加成磷?；袡C(jī)磷親核取代自由基·OH、·CCl3自由基反應(yīng)具有親電氮化合物芳香胺親核取代2.氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的修飾

蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的修飾是通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化合反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。其中的一個(gè)重要作用是用來探測活性部位的結(jié)構(gòu)。理想情況下，修飾試劑只是有選則地與某一特定的殘基反應(yīng)，很少或幾乎不引起蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化。在此基礎(chǔ)上，從該基團(tuán)的修飾對(duì)蛋白質(zhì)分子的生物活性所造成的影響，就可以推測出被修飾的殘基在該蛋白質(zhì)分子中的功能。

3.巰基的化學(xué)修飾

5,5'-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)，又稱為Ellman試劑，目前已成為最常用的巰基修飾試劑。DTNB可與巰基反應(yīng)形成二硫鍵，產(chǎn)生的5-巰基-2-硝基苯甲酸陰離子在412nm具有很強(qiáng)的吸收，可以通過光吸收變化監(jiān)測反應(yīng)程度。有機(jī)汞試劑是最早使用的巰基修飾試劑之一，其中最常用的是對(duì)氯汞苯甲酸，該化合物溶于水形成羥基衍生物，與巰基相互作用時(shí)255nm處光吸收具有較大的增強(qiáng)效應(yīng)。

4.氨基的化學(xué)修飾

有許多化合物都可用來修飾賴氨酸殘基，三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一種。TNBS與賴氨酸殘基反應(yīng)，在420nm和367nm能夠產(chǎn)生特定的光吸收。在蛋白質(zhì)序列分析中，用于多肽鏈N-末端殘基的測定的化合修飾方法—2,4-二硝基氟苯(DNFD)法、丹磺酰氯(DNS)法和)苯異硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基修飾方法。

5.羧基的化學(xué)修飾

水溶性的碳化二亞胺類特定修飾蛋白質(zhì)分子的羧基基團(tuán)，目前已成為一種應(yīng)用最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法，它在比較溫和的條件下就可以進(jìn)行。

6.咪唑基的化合修飾

焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的修飾組氨酸殘基的試劑。該試劑在接近中性的情況下表現(xiàn)出比較好的專一性，與組氨酸殘基反應(yīng)使咪唑基上的1個(gè)氮羧乙基化，并且使得在240nm處的光吸收增加。該取代反應(yīng)在堿性條件下是可逆的，可以重新生成組氨酸殘基。

四、蛋白質(zhì)光譜探針

蛋白質(zhì)的定量測定是生物化學(xué)和其他生物學(xué)科中經(jīng)常涉及的分析內(nèi)容，也是臨床診斷和檢驗(yàn)疾病治療效果的重要指標(biāo)，還是藥物和食品分析的常見項(xiàng)目。所謂蛋白質(zhì)光譜探針，就是能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的無機(jī)離子、有機(jī)小分子或絡(luò)合物，這些物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合生成超分子復(fù)合物之后，體系的光譜性質(zhì)發(fā)生變化，從而可以提供蛋白質(zhì)濃度或結(jié)構(gòu)方面的信息。蛋白質(zhì)的定量分析方法很多，但研究最多、應(yīng)用最廣的還是吸光光度法、熒光分析法和共振光散射等分子光譜探針。

蛋白質(zhì)吸光探針金屬探針雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+生成紫紅色化合物的反應(yīng)。肽和蛋白質(zhì)化合物都有雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色化合物，在540nm具有光吸收。

雙縮脲法Folin-Lowry法

將雙縮脲試劑和Folin酚試劑(磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽）結(jié)合使用，在蛋白質(zhì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)之后，再和Folin酚試劑反應(yīng)，此試劑在堿性條件下被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原，生成顏色