多環(huán)芳烴類污染物對斑馬魚脅迫效應的研究進展

多環(huán)芳烴類污染物對斑馬魚脅迫效應的研究進展周宇淼,張煥新,*,鐘瑋,孔強,#

1.山東師范大學地理與環(huán)境學院,濟南250000

2.山東省濟南市生態(tài)環(huán)境局章丘分局,濟南250200

自然環(huán)境中的多環(huán)芳烴(PAHs)主要是由礦質燃料如煤、石油等有機高分子化合物在不完全燃燒時產生的[1]。水域中,PAHs的入侵途徑主要有工農業(yè)廢水排放、大氣污染物沉降、固體廢物滲瀝和土壤環(huán)境遷移等,對水生生物構成一定的威脅。采用模式生物斑馬魚(Daniorerio)作為受試生物可以快速有效地揭示PAHs對水生生物的毒性效應及其機理。作為易于使用的體內模型,斑馬魚及其胚胎和幼魚正越來越多地被用于評估污染物毒性作用,并對機體損傷的各種機制具有良好的預測能力[2]。而對于環(huán)境污染物的毒性表征,生物組學方法(如高通量測序、微陣列和核磁共振)已被廣泛應用于確定分子水平上的變化[3]。通過研究PAHs對斑馬魚的毒理效應,可為評估PAHs對水生生物的生態(tài)毒性效應提供依據,這為降低水體PAHs的毒性效應,減少和治療污染物對人類健康的損傷提供關鍵信息。此綜述系統(tǒng)描述了PAHs的毒性作用機制,更為直觀地評價了環(huán)境中污染物的生態(tài)風險,為進一步探究水體有機污染物對水生生物及人類健康的影響提供理論依據。

近年來國內外關于PAHs污染對于模式生物的生理毒性研究逐漸增多。通過不同途徑將斑馬魚暴露于PAHs類污染物中可獲得大量的毒理學數據,明晰了此類污染物對于斑馬魚脅迫效應的具體損傷機制,這對于豐富污染物毒性效應數據、發(fā)展毒理學應用以及對人類疾病的發(fā)現(xiàn)和治療都有獨特的意義。時至今日,關于PAHs暴露對于斑馬魚抗氧化防御機制的文獻已不在少數,但缺少系統(tǒng)性的歸納、分析和解釋。于此,本文旨在前人研究基礎之上,重點綜述不同種類不同濃度的PAHs暴露對于斑馬魚及其幼魚和胚胎的毒性效應和實質性表征,分析短期和少量長期作用效果的差異及組織結構的顯著變化等,解釋和闡明PAHs毒性發(fā)生發(fā)展的分子機制,最后對該領域研究的必要性和研究前景進行闡釋。

1PAHs脅迫對斑馬魚行為、生長發(fā)育和組織結構的影響(EffectsofPAHsstressonthebehavior,growthandtissuestructureofzebrafish)

生物的行為反應以及致死致畸等效應是生物體面對外界環(huán)境刺激時體內生理變化的外在響應[4],斑馬魚大腦在功能和形態(tài)上與哺乳動物的大腦相似,且對污染物外在反應響應敏感、迅速,因此經常被應用于生態(tài)毒理學的研究中。

1.1行為學的影響

受到PAHs的脅迫后,斑馬魚的神經、代謝和免疫將通過運動系統(tǒng)的支配對應激、逆轉和位移等行為學指標產生影響。Mohanty等[5]研究了PAHs對斑馬魚行為學和抗氧化防御機制的脅迫,最終得知斑馬魚暴露于水中的苯并[a]芘(B[a]P)后,發(fā)生了趨暗行為的逆轉,這可能與斑馬魚腦室周圍灰色區(qū)(PGZ)的神經形態(tài)學改變有關。Das等[6]經過較長時間記錄發(fā)現(xiàn),長期暴露于B[a]P中會顯著損害斑馬魚的運動、活動能力,其主要表現(xiàn)為總移動距離和速度的減少。Vignet等[7]通過飼喂的手段使斑馬魚和不同濃度PAHs組分長期接觸,發(fā)現(xiàn)暴露組的斑馬魚相較于對照組表現(xiàn)出較高的活動性、較低的探索活動水平和較高的焦慮水平。除此之外,其他因素也會影響PAHs對斑馬魚的毒性表現(xiàn),Aparna和Patri[8]發(fā)現(xiàn)水體過度擁擠產生的應激效應可調節(jié)B[a]P誘導的斑馬魚行為改變,導致成年斑馬魚大腦主導學習和記憶缺陷的組織出現(xiàn)病理學改變。

1.2生長發(fā)育的影響

PAHs對于斑馬魚的生長發(fā)育毒性是較為常規(guī)的有機污染物毒性指標,斑馬魚與PAHs接觸后會引發(fā)致死效應或敏感部位如心血管、消化道和生殖器官等的損傷。在此主要介紹PAHs暴露后短期產生的急性毒性效應和對斑馬魚生長發(fā)育過程中組織結構的影響。

斑馬魚暴露于PAHs中后,產生急性應激毒性效應是最普遍的表型現(xiàn)象之一,且對于斑馬魚的幼魚和胚胎的病理損傷作用更為明顯。為了揭示特征污染物對斑馬魚的內在毒性作用機制,一般以生物標志物作為指示參數來測定污染物對斑馬魚的亞致死或致畸效應[9]。如Alves等[10]分析了加油站油水分離器排放的廢水中所含的PAHs對于斑馬魚的毒性作用,發(fā)現(xiàn)21.8×10-2mg·L-1萘(Nap)暴露96h,對50%的斑馬魚幼魚都產生了明顯的有效毒害作用。Perrichon等[11]將斑馬魚胚胎及幼魚暴露于2種含PAHs的化石燃油組分(brut阿拉伯輕質燃料油和Erika重燃料油)中后,發(fā)現(xiàn)暴露于Erika組分中的斑馬魚在生命早期階段就產生了高度的應激反應。Li等[12]發(fā)現(xiàn)GM-2分散劑可以增強原油對斑馬魚的損傷效應,這是由于GM-2分散劑增加了原油對斑馬魚的暴露量。蔡吉榛等[13]為探究近海域沉積物中含氯多環(huán)芳烴(ClPAHs)的生物學毒性作用,將斑馬魚胚胎暴露于含有2種不同濃度PAHs的湛江水體底泥沉積物提取物中,并且發(fā)現(xiàn)胚胎的致死效應和致畸程度與提取物中ClPAHs濃度呈現(xiàn)正相關。

還有其他研究表明,光照能夠誘導PAHs對斑馬魚的氧化損傷作用增強。例如Willis和Oris[14]研究發(fā)現(xiàn),施加高強度的紫外線(UV)輻射后,水中一定濃度(如蒽(Ant)1mg·L-1)的PAHs對斑馬魚毒性顯著增加。更有文獻表明石油暴露對斑馬魚產生毒性的物質可能不止PAHs,González-Doncel等[15]發(fā)現(xiàn)對斑馬魚產生的有效毒性作用與直接的石油暴露有關,且毒性機制不僅是PAHs單獨暴露的作用機制,這需要進一步確定是哪些石油成分引發(fā)了與單獨PAHs暴露不同的毒性效果。

自然環(huán)境中的PAHs不止以原始形態(tài)存在,其易受到其他氧化作用如光化學氧化和微生物轉化等生成酮、酚、酯和羧酸等氧化產物,為此,Diamante等[16]對暴露于羥基化PAHs中的斑馬魚胚胎進行觀察,最終發(fā)現(xiàn)其產生的發(fā)育毒性使斑馬魚存活率顯著下降并觀察到循環(huán)缺陷,同時血紅蛋白水平下降明顯。

1.3對于組織結構的影響

PAHs暴露一段時間后由于其持久性和生物蓄積性等固有特性,會在斑馬魚的組織中逐漸積聚進而產生負面影響。當暴露的水環(huán)境中含有一定濃度的PAHs時,被斑馬魚吸入、吞食或接觸吸收的PAHs會在其組織和器官中不斷蓄積,對組織產生影響進而出現(xiàn)不良反應。Zhai等[17]的研究表明,斑馬魚對PAHs的吸收主要發(fā)生于頭部和消化道內,且附著于懸浮顆粒上的PAHs更容易被斑馬魚的組織吸收并產生生物富集效應。當懸浮顆粒濃度為500mg·L-1時,斑馬魚對芘(Pyr)和氟蒽(Flu)的吸收速率常數分別增加了16.4%~109.3%和21.8%~490.4%。Xie等[18]將斑馬魚暴露于0.1mg·L-1B[a]P15d后,發(fā)現(xiàn)斑馬魚腸道內常見的致病菌如葡萄球菌顯著增多,導致斑馬魚腸道微生物失調并引發(fā)炎癥,此外,B[a]P顯著提高了斑馬魚白介素il1β的mRNA的轉錄水平,其中il6、il8、il10和ifnphi1轉錄水平顯著升高。Vignet等[19]通過飼喂使斑馬魚暴露于PAHs中,并在個體、組織和分子水平上分析了生殖性狀的差異性,組織學分析顯示暴露組斑馬魚表現(xiàn)出明顯的卵巢發(fā)育成熟缺陷。Hicken等[20]使斑馬魚胚胎直接暴露于含有極低濃度PAHs(∑PAH=2.4×10-2~3.6×10-2mg·L-1)原油中,當胚胎短暫暴露時會引起亞致死、反應延遲等效應,而胚胎暴露近1a后,成年后的斑馬魚的心臟形狀出現(xiàn)了細微變化,心血管輸出量減少,游泳能力顯著下降。

綜上所述,PAHs確實可以對魚類正常的組織結構產生干擾,并通過不同的成分觸發(fā)不同的途徑,從而產生不同的影響。

2PAHs脅迫對于斑馬魚生理生化指標的影響(EffectsofPAHsstressonphysiologicalandbiochemicalindexesofzebrafish)

當水環(huán)境受到各種有毒物質污染,尤其是PAHs匯入時,如何在短時間內檢測、評估其污染效應成為生態(tài)毒理學研究的重點問題之一,模式生物的生理生化毒性效應檢測作為一種優(yōu)良研究手段應運而生。PAHs對斑馬魚產生脅迫效應時,生物本身會通過反饋調節(jié)相關酶的活性,進而調節(jié)代謝速率;或通過激素調節(jié)影響生物的脂質代謝過程,因此酶活性和脂質代謝的改變往往作為研究脅迫效應的基礎指標。

2.1代謝酶和抗氧化酶活性的改變

自然環(huán)境中的PAHs常以復雜混合物的形式出現(xiàn),一些混合物已被證明在斑馬魚及其胚胎中有擾亂代謝的作用,導致其體內的代謝酶活性變差而引起協(xié)同發(fā)育毒性。Wang等[21]發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚體內PAHs濃度與代謝酶活性存在相互作用關系。隨著PAHs濃度的增加,細胞色素P450(CYPs)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性開始升高,當PAHs濃度達到峰值時,活性下降到最低狀態(tài)。Timme-Laragy等[22]發(fā)現(xiàn)在斑馬魚模型中,含PAHs的復雜混合物的毒性是由芳香烴受體2(AHR2)介導的,并通過抑制cyp1a酶活性而增強毒性效應,cyp1a基因表達被抑制后會改變斑馬魚的正常代謝,進而對斑馬魚的生存和發(fā)育過程產生影響。Wincent等[23]的研究結果表明,含氧多環(huán)芳烴(oxy-PAHs)混合物作為一種強有力的Ahr激活劑,可以誘導斑馬魚體內的谷胱甘肽硫轉移酶(GST)活性改變,同時表現(xiàn)出顯著的發(fā)育毒性。Kim等[24]將斑馬魚幼魚暴露于一定濃度(2.5×104mg·L-1)的伊朗重質原油含水餾分(WAFs)中5d,發(fā)現(xiàn)其甲狀腺內過氧化氫酶活性水平顯著下降,甚至破壞了斑馬魚幼魚的甲狀腺功能。除此之外仍有少量聯(lián)合毒性的研究,如譚敏卿[25]首次研究了菲(PHE)與高氯酸鈉對斑馬魚的聯(lián)合毒性效應,發(fā)現(xiàn)2種物質均導致斑馬魚胚胎的畸形率、死亡率升高,心率和孵化率降低且對SOD的影響為先抑制后誘導,并得出PHE與高氯酸鈉對斑馬魚的聯(lián)合毒性作用為拮抗。此數據為二者聯(lián)合毒性研究提供重要依據。

所以當外界環(huán)境中的PAHs對斑馬魚產生脅迫效應時,其體內會產生大量的自由基,進而刺激自身抗氧化防御機制酶發(fā)揮作用,對機體進行保護。據上述可知,斑馬魚體內代謝酶活性的改變是抵御PAHs毒性作用的重要表征。

2.2對脂質代謝的影響

暴露于PAHs時,斑馬魚的肝臟炎癥總是伴隨著脂質氧化,PHE是一種典型的PAHs,會導致斑馬魚脂質代謝紊亂。如Mai等[26]將斑馬魚暴露于PHE(0.3mg·L-1)中15d,GO富集分析表明PHE誘導了脂質轉運體活性、脂質轉運和跨膜轉運相關基因的表達變化,引起脂肪消化吸收通路富集,導致肝臟細胞肥大、血液積聚、白細胞增多及巨噬細胞數量增加。

斑馬魚作為僅次于小鼠的一種優(yōu)秀的體內模型在當下研究中應用甚廣,但體外模型的建立仍有很大的研究空間。Ning等[27]首次利用體外模型評估了PAHs類對脂質代謝的作用,結果表明,5種硝基多環(huán)芳烴(NPAHs)暴露組中有4種組分表現(xiàn)出明顯的靶向雌激素受體α(ERα)激動活性,并誘導HepG2細胞分泌17β-雌二醇(E2)。由此證明NPAHs通過ERα信號通路誘導潛在的脂質毒性。

這些研究為持久性有機污染物誘導的功能蛋白酶和脂質代謝干擾作用提供了新的視角,并為更好地理解PAHs的環(huán)境風險提供了思路。

3PAHs對斑馬魚脅迫效應分子機制的研究進展(ResearchprogressonmolecularmechanismofPAHsstresseffectonzebrafish)

分子機制是指生物機體結構組成部分的相互關系,以及其間發(fā)生的各種變化過程的物理、化學性質和相互關系[28]。在實驗室條件下,可利用分子、細胞生物學等研究手段闡明脅迫毒性發(fā)生發(fā)展的分子機制,篩選出生物標志物,確定污染物致癌致畸效應干預的靶點,于此可對機體損傷修復提供分子依據。評估環(huán)境污染物對于斑馬魚的毒性效應時采用全基因組的差異表達基因分析,其數據可以很好地闡明暴露的毒性效應及其相關的機制[29]。

3.1轉錄組學

與環(huán)境相關的PAHs對斑馬魚脅迫效應的研究不僅需要聚焦于其致癌作用,更需要了解其引起的發(fā)育毒性作用的細胞分子機制。比如在脊椎魚類動物細胞中,PAHs多集中在脂滴中,可觸發(fā)生物轉化、氧化應激和炎癥等基因的上調。

研究基因分子的差異化多采用實時熒光定量PCR技術(qPCR)。如Bui等[30]使吸附于納米煙塵顆粒上的PAHs與斑馬魚直接接觸8d以上,應用高通量測序和qPCR得出與生物轉化、氧化應激和谷胱甘肽相關的代謝通路的調控基因如Hmox1和Nqo1上調,熒光分析的結果表明PAHs主要積累于斑馬魚的脂質細胞中并導致其胚胎發(fā)育異常。Shankar等[31]將斑馬魚暴露在16種常見PAHs中,結合發(fā)育毒性表型終點和全基因組轉錄組學對脅迫48hpf斑馬魚胚胎的16種PAHs進行毒性分類,確定mRNA表達水平的下游變化,發(fā)現(xiàn)暴露組cyp1a轉錄水平顯著升高并主要激活了Ahr2,這會導致斑馬魚尾鰭發(fā)育畸形而進一步阻礙其運動行為。Garcia等[32]也證明了這種由PAHs暴露引起的基因差異性表達,發(fā)現(xiàn)在PAHs暴露組的斑馬魚中,可調節(jié)軟骨發(fā)育的slincR基因被sox9b5’UTR抑制轉錄,導致斑馬魚體外出血,并發(fā)現(xiàn)slincR基因出現(xiàn)上調,而導致斑馬魚軟骨發(fā)育異常繼而出現(xiàn)顱面畸形。這些研究都表明PAHs的毒性作用機制是觸發(fā)應激基因表達差異。

差異基因的凸顯可能會進一步導致各種胚胎發(fā)育缺陷。McIntyre等[33]發(fā)現(xiàn)含PAHs濃度相對較高(9×10-3mg·L-1和1.6×10-3mg·L-1)的雨水會驅動斑馬魚胚胎的心環(huán)缺陷和心房反流,這些可見缺陷的嚴重程度與解毒酶cyp1a的表達以及與心臟收縮功能缺陷通路相關的基因(nppb＞myl6＞myl7)相對應,斑馬魚心臟發(fā)育異常以及小眼、孵化延遲和魚鰾的異常膨脹等表型可以證明魚類生命早期階段對PAHs的毒性影響非常敏感。Fang等[34]也同樣使用了qPCR技術進行脅迫效應分析,將斑馬魚幼魚和胚胎暴露于含B[a]P的水環(huán)境3.3hpf時,B[a]P激活了包括機體死亡、生長衰竭、先天性心臟病、出血和頭部形態(tài)異常等發(fā)育途徑,產生顯著性差異的基因如als2a、cep70和mycbp2主要富集于細胞形態(tài)控制和染色體凝聚通路中,以上基因表達使斑馬魚幼魚呈現(xiàn)出死亡率增加、孵化延遲、心臟水腫和頭部形態(tài)發(fā)育異常。所以實驗期間斑馬魚在基因、轉錄變異和外顯子水平上發(fā)生了顯著的轉錄組變化,且這些變化可能導致長期不利的生理后果,而探究PAHs對于斑馬魚的長期作用效果的相關研究還有待完善。

還有一些研究也進一步證實了PAHs的暴露會引起表觀遺傳的改變。由于pdx-1β是細胞分化至關重要的啟動子,Yun等[35]通過轉錄組學和qPCR對低濃度9芴酮(9-FLO)暴露后24hpf時斑馬魚胚胎中pdx-1啟動子區(qū)8個CpG位點的甲基化水平進行了評估,發(fā)現(xiàn)在斑馬魚胚胎時期低濃度oxy-PAHs的暴露會使pdx-1啟動子區(qū)域的DNA甲基化程度增加,因此得出9-FLO毒性作用是通過調控DNA甲基化、增加葡萄糖水平和降低心率來破壞胰腺器官的發(fā)育。

總的來說,在任何污染物引發(fā)的魚類發(fā)育與生殖健康的風險評估中,采用分子的方法更有利于幫助研究人員研究脅迫相關的關鍵調控因子,從而提高研究效率。

3.2代謝組學

環(huán)境代謝組學是一種相對較新的分子技術,可用于評估化學暴露的生物后果。代謝物模式的變化可用于表征由化學物質引起的毒性反應,代謝組學分析可以是有針對性的,對已知的代謝物進行定量,也可以是無針對性的,對所有已知和未知的代謝物進行綜合分析。如Elie等[36]采用了一種非靶向代謝組學方法來檢測斑馬魚(Daniorerio)的體內代謝譜,將斑馬魚暴露于苯并[a]蒽(BAA)和苯并[a]蒽-7,12-二酮(BAQ)中,通過多因素、單因素和通路富集分析并基于KEGG數據庫路徑研究斑馬魚代謝物的變化,發(fā)現(xiàn)BAA和BAQ暴露主要會擾動氨基酸代謝,差異代謝物富集在:谷胱甘肽代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,半胱氨酸和蛋氨酸代謝,初級新陳代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝以及氨酰生物合成等通路中。以上代謝通路改變會引起DNA氧化損傷、誘導心臟功能發(fā)育和血管供氧障礙。

也有一些研究同樣證明了PAHs會對斑馬魚代謝產生干擾作用。如Sogbanmu等[37]將Nap、PHE、Pyr和B[a]P等PAHs的單獨暴露效果進行比較,發(fā)現(xiàn)PHE對斑馬魚代謝具有顯著的有害影響,并在處理后72hpf出現(xiàn)了高水平的致畸效應,如組織水腫增加、出血和發(fā)育異常等。Fujita等[38]將含有PAHs的稀釋瀝青的沉積物衍生水溶性組分(SDWSF)對斑馬魚進行暴露,并利用代謝組學研究SDWSF的胚胎毒性機制,使用單變量和多變量分析統(tǒng)計出9個代謝產物,其中有5種是標準氨基酸,即丙氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、蘇氨酸和酪氨酸,其他4種分別是甜菜堿、?；撬?、肌苷和甘油,在100%SDWSF處理下,這些代謝產物的豐度均發(fā)生了顯著變化,由此可見含PAHs的混合物會對斑馬魚代謝通路產生影響,繼而引發(fā)死亡、心包水腫和卵黃囊水腫等毒性效應。在斑馬魚的受試組織肝臟中細胞分子的損傷程度一般可以通過測定DNA的甲基化程度來實現(xiàn)。陳宏姍等[39]將斑馬魚雌魚和胚胎暴露于Nap,實驗數據表明Nap有明顯的發(fā)育毒性并出現(xiàn)濃度依賴性,甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)方式檢測得出DNA甲基化程度在肝臟中的嚴重性明顯高于肌肉組織,且肝臟中低濃度(8.4×10-5mg·L-1)和高濃度(8.4×10-1mg·L-1)組的基因組總甲基化水平分別比對照組高出了12.88%和8.16%,可見PAHs可通過擾亂斑馬魚物質代謝使DNA甲基化,從而造成中樞神經、肝臟和腦發(fā)育異常。

以上多采用無針對性代謝物分析,這種方法可以用圖形描述模式的任何顯著差異,這使獲得有關毒性機制、途徑和暴露生物標記物的信息成為可能。

4斑馬魚在生態(tài)毒理學中應用的必要性及研究展望(Thenecessityandresearchprospectofzebrafish’sapplicationinecotoxicology)

人類對環(huán)境的污染負荷已經對生物構成了嚴重威脅,研究污染物對生物的具體毒性作用機制以及修復機理刻不容緩。已有大量報道表明,暴露于環(huán)境毒物如PAHs中時,很可能會引起生物個體抗氧化防御系統(tǒng)的病理性改變。由于人類壽命長且后代數量相對較少,因此很難直接了解PAHs暴露的潛在和世代相傳的影響,而斑馬魚作為一個標志性的模型生物,具有培養(yǎng)簡單、毒性評價指標多樣化等典型特點,其胚胎和幼魚可作為高通量分子篩選的實驗模式生物,既彌補了細胞模型的單一性,又彌補了嚙齒動物模型的受試時間長、養(yǎng)殖周期長等不足,并且被廣泛應用于環(huán)境污染物的毒性效應研究,特別是環(huán)境中持久性有機污染物毒性作用評估。斑馬魚作為近10年來研究生態(tài)毒理機制的理想體內模型生物,先前的研究表明,斑馬魚與人類基因組有70%~80%的同源序列[40],二者的乙酰膽堿酯酶(AchE)也有62%的相似氨基酸序列[41]。斑馬魚也表現(xiàn)出與人類一樣的抗氧化保護系統(tǒng),以對抗環(huán)境中的有毒物質[42]。由于一些PAHs與身體組織的親脂性親和力,某些PAHs與氧化應激之間的相互聯(lián)系代謝是斑馬魚多種病理過程中的決定性調節(jié)因子之一。PAHs不僅在斑馬魚的胚胎中具有發(fā)育毒性,而且還影響其心臟的發(fā)育和相關基因的表達。PAHs細胞代謝產生的次生代謝產物通過改變斑馬魚的抗氧化防御狀態(tài),破壞其細胞膜脂質和細胞蛋白。因此掌握PAHs對斑馬魚的毒性作用機制和斑馬魚體內研究的優(yōu)勢性可進一步減弱PAHs及其新合成物或化合物的商業(yè)使用對人體健康造成的潛在危害。

通過本文的歸納分析可以看出,斑馬魚暴露于PAHs時,具體表現(xiàn)如下。(1)其運動能力會被明顯抑制,其效應在短時間低劑量