T-HSPP 0005-2022 茄科植物攜帶柑橘裂皮類病毒檢測技術(shù)規(guī)程

T/HSPP0005—2022 前 言..........................................................................................................................................................II1

范圍.............................................................................................................................................................. -

1

-2

規(guī)范性引用文件.......................................................................................................................................... -

1

-3

術(shù)語和定義.................................................................................................................................................. -

1

-4

柑橘裂皮類病毒分類信息.......................................................................................................................... -

1

-5

儀器和試劑.................................................................................................................................................. -

1

-儀器設(shè)備........................................................................................................................................... -

1

-主要試劑........................................................................................................................................... -

1

-6

檢測流程圖.................................................................................................................................................. -

1

-7

檢測方法...................................................................................................................................................... -

1

-樣品制備........................................................................................................................................... -

2

-7.1.1

種子類............................................................................................................................................. -

2

-7.1.2

種苗類............................................................................................................................................. -

2

-

提取.......................................................................................................................................... -

2

-

..................................................................................................................................... -

2

-分子雜交........................................................................................................................................... -

2

-結(jié)果判定........................................................................................................................................... -

3

-8

留樣保存與結(jié)果記錄.................................................................................................................................. -

3

-留樣保存........................................................................................................................................... -

3

-結(jié)果記錄........................................................................................................................................... -

3

-................................................................................................................................................... -

3

-附 錄 A（參考性附錄）柑橘裂皮類病毒基本信息...............................................................................-

4

-附 錄 B（參考性附錄）核酸提取方法...................................................................................................-

5

-附 錄 C（參考性附錄）分子雜交方法...................................................................................................-

6

-附 錄 D（規(guī)范性性附錄）柑橘裂皮類病毒檢測流程圖.......................................................................-

8

-T/HSPP0005—20221 范圍本文件規(guī)定了柑橘裂皮類病毒的檢測技術(shù)規(guī)程。本文件適用于番茄、辣椒、馬鈴薯等茄科植物種子及種苗中柑橘裂皮類病毒的檢測和鑒定。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

6682

分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法SN/T

2964

植物病毒檢測規(guī)范3 術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4 柑橘裂皮類病毒分類信息中文名：柑橘裂皮類病毒學(xué)名：Citrus

類病毒名及縮寫：

，CEVdPospiviroidaePospiviroid）。柑橘裂皮類病毒的基本信息參見附錄A。5 儀器和試劑儀器設(shè)備0.001g凍離心機、臺式小型離心機、恒溫加熱器、生物安全柜、制冰機、普通PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、2.5μL，10μL、20μL，200，1000

）、常規(guī)冰箱、超低溫冰箱等。主要試劑除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑，實驗用水應(yīng)符合GB/T

6682中一級水的規(guī)格。商品化TrizolDNAPCR緩沖液、引物和探針、乙酸電泳緩沖液，硝酸銀溶液等。核酸提取相關(guān)試劑符合附錄B的要求；分子雜交試劑應(yīng)符合附錄C的要求。6檢測流程圖柑橘裂皮類病毒檢測流程圖見附錄DSN/T2964中的規(guī)定執(zhí)行。7 檢測方法-1-引物名稱引物序列（5'-3'）產(chǎn)物大?。╞p）CEVd371F371CEVd371RGGAAACCTGGAGGAAGTCGT/HSPP0005—2022樣品制備7.1.1

種子類每份送檢樣本中選取100~200粒種子，表面消毒后，置于鋪有吸水紙的白瓷盤或培養(yǎng)皿中，20℃~25℃、12

h/12

h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)直至萌發(fā)。隨機抽取葉片1

g~5

g，置于去RNA酶的研缽中，加入液氮后迅速研磨成細粉狀，制成檢測樣品。7.1.2

種苗類g~200

g葉片置于去酶的研缽中，加入液氮后迅速研磨成細粉狀，制成檢測樣品。RNA

取制備好的檢測樣品100Trizol法提進行總RNACEVd的茄科植物樣本作為陽性對照，以無CEVd茄科植物樣本作為陰性對照，同時進行提取。具體操作步驟參見附錄B。核酸提取也可選擇相應(yīng)商業(yè)化試劑盒。RT-PCR

7.3.1 cDNA

合成0.2

mL

PCR管中加入DEPC處理去離子水10

μL、模板RNA

3

μL（50

ng~200

ng），隨機引物1

，95℃735×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4、10dNTPs、U/μLRNAase）0.5、200U/μL

M-MLV），混勻后37℃水浴1h轉(zhuǎn)錄結(jié)束后瞬時離心，95℃（或沸水）水浴5

，冰浴3

，直接進行PCR擴增。cDNA合成也可采用相應(yīng)商業(yè)化試劑盒。7.3.2 PCR

反應(yīng)體系：0.2mLPCR管中加入10×PCRbufferMg）2.5μL，dNTPs（10）2μL（均為10μ）各μL（見表1），5U/μL酶0.5μL，模板cDNA3μL，加DEPC處理水至總體積25

。每個樣品設(shè)置兩個平行反應(yīng)，以雙蒸水代替模板作為空白對照。表

1

反應(yīng)特異性引物及序列反應(yīng)程序：95℃

5

；℃

30

s，56℃

30

s，72℃

s，35個循環(huán)；72℃表

1

反應(yīng)特異性引物及序列也可采用一步法RT-PCR商業(yè)化試劑盒，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件可根據(jù)說明書進行適當(dāng)調(diào)整。7.3.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測制備1.5%1加樣緩沖液與5μLRT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物混勻進行點樣，采用后，凝膠成像檢測擴增產(chǎn)物。7.3.4 測序分析（可選）對RT-PCRGenBank數(shù)據(jù)庫中已知的CEVd序列進行相似性比對分析，驗證樣品檢測結(jié)果。分子雜交采用RocheCEVd-20℃33的尼龍膜在雜交爐上68℃進行預(yù)雜交1h2μLRNA探針雜交10h化學(xué)發(fā)光法進行雜交檢測。具體操作步驟參見附錄C。-2-T/HSPP0005—2022結(jié)果判定對照成立的前提下，檢測結(jié)果按照以下原則進行判定：——RT-PCR和分子雜交兩種檢測方法均為陽性，可判定樣品中攜帶有柑橘裂皮類病毒；——樣品RT-PCR檢測或分子雜交檢測結(jié)果為陽性，經(jīng)測序分析驗證與已知的CEVd序列相似性達90%以上，可判斷樣品攜帶柑橘裂皮類病毒；——RT-PCR和分子雜交兩種檢測方法均為陰性，可判定樣品未攜帶柑橘裂皮類病毒。8 留樣保存與結(jié)果記錄留樣保存7.1剩余制樣于℃6個月。保存期滿后，應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方可處理。結(jié)果記錄RT-PCR檢測結(jié)果電泳照片、分子雜交檢測結(jié)果照片、測序報告和序列分析結(jié)果圖應(yīng)一并保存。建檔員簽字等。-3-

附

錄 A（資料性附錄）柑橘裂皮類病毒基本信息A.1 寄主范圍蕓香科（）、馬鈴薯（

）、番茄（Solanum

lycopersicum）、melongena×hybrid）、蠶豆（fabaDaucusPetunia（Gynura）、柑橘屬（Citrus）、香櫞（Citrus

medica）等。A.2地理分布目前已報道發(fā)現(xiàn)CEVd的國家有澳大利亞、斐濟、湯加、新西蘭、非洲南部、俄羅斯、伯、泰國、以色列、印度、越南、中國等。A.3傳播途徑通過嫁接、花粉、種子和刀具機械傳播。遠距離通過種苗調(diào)運傳播。A.4病害癥狀主要由于田間存在不同的CEVd株系。CEVd的株系是根據(jù)在不同的砧木/接穗的柑橘上的癥狀嚴(yán)重程來劃分的，弱毒株系存在于葉片中，引起矮化癥狀，而強毒株系則引起裂皮癥狀。A.5 CEVd基因組特征CEVd基因組為單鏈環(huán)狀分子，基因組大小約

nt，GC含量高，分子內(nèi)部堿基配對形成穩(wěn)定的桿狀或擬桿狀二級結(jié)構(gòu)，在一定條件下可形成發(fā)夾狀變形結(jié)構(gòu)。CEVd基因組包含5個功能區(qū)：左末端區(qū)(TL)、致病區(qū)(P)、中央保守區(qū)(C)、可變區(qū)和右末端區(qū)。-4-附

錄 B（資料性附錄）核酸提取方法B.1

核酸提取相關(guān)試劑DEPC處理超純水：取制備好的去離子水

mL，加入500

μLDEPC搖床震蕩過夜，高溫高壓滅菌后室溫保存；1

（pH

8.0）：稱取

g

，加50

mLDEPC處理超純水溶解，用濃HCl調(diào)8.0，定容至

mL，高溫高壓滅菌后室溫保存；0.5

（

8.0）：稱取18.61

g

NaO80

處理超純水溶解，用約2

g

NaOH調(diào)

值至，加DEPC

100

μL，定容至100

，搖床震蕩過夜，高溫高壓滅菌后室溫保存；10×TE

（）：取1

（

）

mL和0.5

（pH8.0）

2

mL，加

mLDEPC處理超純水溶解，定容至100

mL，高溫高壓滅菌后室溫保存。B.2

核酸提取稱取制備的檢測樣品

mg，轉(zhuǎn)入已滅菌的去酶離心管；立即加入1

，渦旋振蕩15

s，室溫靜置15

μL氯仿，上下顛倒混勻，室溫靜置2

，4℃

12000

15

；取上清于新的離心管中，加無加入等體積的異丙醇沉淀，輕微顛倒，沉降；

離心15

；棄上清，沉淀中加1

mL

預(yù)冷的75

%酒精，上下顛倒1012000

5

20

s，吸去多余液體，室溫干燥5-10，加30

μLDEPC處理的去離子水溶解，-80

℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ部蛇x擇市售商品化提取試劑盒進行核酸提取。-5-附

錄 C（參考性附錄）分子雜交方法C.1試劑與材料C.1.1核酸雜交相關(guān)試劑20×SSC

175.3g，88.2g

檸檬酸鈉O

800mL

HCl調(diào)

，最后用定容至

1

L，高溫高壓滅菌后室溫保存；

溶液：稱取

1

g

Ficoll

，1

g

PVP-40，1

g

BSA，溶解于

80

mL

去離子水，定容至

100

，過濾除菌及雜質(zhì)后-20

℃貯存；預(yù)雜交液：6×、5×Denhardt

溶液、50%(w/v)、0.5%(w/v)、μg/mL鮭魚精

DNA（用前加熱變性后加入）；雜交液：預(yù)雜交液中加入

DIG-RNA

探針，稀釋成適當(dāng)濃度；封閉液：將

0.73

g

NaCl，

g

NaHPO，

g

NaHPO，5

g

SDS

80

水中，定容至

100

，過濾除菌后室溫保存；洗滌液

I

1/10

稀釋的封閉液；洗滌液

II：將

0.24

g

，

g

NaCl，0.4

g

MgCl

水中，用

HCl

調(diào)pH

至

9.5，定容至

200

，過濾除菌后室溫保存；:MOPS

）

MOPS(pH7.0)、50NaAc、；:Maleic

acid

緩沖液：100

Maleic

a