微生物的數(shù)量和大小測定2011.9.28

實(shí)驗(yàn)4微生物大小和數(shù)量測定學(xué)習(xí)使用鏡臺測微尺和目鏡測微尺在顯微鏡下測定微生物大小的方法。(一)微生物大小的測定一、目的要求對于病毒、細(xì)菌、放線菌、真菌和原生動物等不同類型的微生物來說，它們的大小存在很大的差異。在同一類型中不同種類的微生物，或同一種類中不同時期的微生物個體，它們的大小也存在很大的差異。二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2、器材：顯微鏡、鏡臺測微尺、目鏡測微尺三、實(shí)驗(yàn)步驟1、目鏡測微尺的校正鏡臺測微尺有刻度的一面朝上，置顯微鏡載物臺上，先在低倍鏡下，將鏡臺測微尺有刻度的部分移至視野中央。轉(zhuǎn)動目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用移動器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺微尺和目鏡微尺所占的格數(shù)。計算40x下目鏡測微尺的校正值。目鏡測微尺每格長度（um）＝兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)×10/兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)2、細(xì)胞大小的測量酵母菌懸液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，置顯微鏡載物臺上。用目鏡測微尺測量細(xì)胞寬和長。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計算出目鏡測微尺校正結(jié)果以及酵母菌大小測定結(jié)果四、思考題1、為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進(jìn)行校正？2、在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一細(xì)菌的大小時，其測定結(jié)果是否相同？為什么？1、明確血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)的原理。2、掌握使用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行微生物計數(shù)的方法。

(二)微生物數(shù)量的測定一、目的要求二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞總數(shù)的測定（包括活的和已喪失活力的細(xì)菌）1、比濁法2、染色涂片計數(shù)法3、顯微直接計數(shù)法1、比濁法比濁法的原理是利用細(xì)菌細(xì)胞在溶液中數(shù)量越多，濁度越大，在光電比色計中測定時所吸收的光線越多。2、染色涂片計數(shù)法取0.01ml的菌懸液放在1cm2的玻片上，讓其干燥，然后固定染色，再置顯微鏡下計數(shù)每一視野中的菌數(shù)，算出視野面積，按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌數(shù)。每ml原菌液中的含菌數(shù)=視野中的平均菌數(shù)×1cm2/視野面積×100×稀釋倍數(shù)3、顯微直接計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種方法。顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。缺點(diǎn)是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色，微室培養(yǎng)等方法來達(dá)到只計數(shù)活菌體的目的。

血細(xì)胞計數(shù)板由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室是由一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；共計400個小方格。每一個大方格的面積為1mm2，蓋玻片與計數(shù)區(qū)之間的高度為0.1mm，所以計數(shù)室的容積為0.1mm3。計數(shù)時，通常在40×下數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，以及大方格中的總菌數(shù)，再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。(1ml=?mm3)１個計數(shù)室＝１×１mm包含５×５個中方格１個中方格＝４×４個小方格三、實(shí)驗(yàn)器材

1、菌種：釀酒酵母2、器材：顯微鏡、血球計數(shù)板等四、實(shí)驗(yàn)步驟1—顯微直接計數(shù)法

1、在10×和40×下找到計數(shù)室。2、蓋上蓋玻片將搖勻的釀酒酵母菌（或大腸桿菌）懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動進(jìn)入計數(shù)室。如滴入過多，溢出并流入兩側(cè)槽內(nèi)，使蓋玻片浮起，體積改變，會影響計數(shù)結(jié)果，需用濾紙把多余的溶液吸出，以槽內(nèi)沒有溶液為宜。如滴入溶液過少，經(jīng)多次充液，易產(chǎn)生氣泡，應(yīng)洗凈計數(shù)室，干燥后重做。

3、靜止5min（為什么），先用低倍鏡將計數(shù)室移至視野中央。4、在高倍下計數(shù)：每個計數(shù)室選5個中格(4個角和中央的一個中格)中的菌體進(jìn)行計數(shù)。對于分布在刻線上的細(xì)菌，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進(jìn)行計數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、統(tǒng)計五個大格中的細(xì)胞數(shù)量記數(shù)大格12345細(xì)胞記數(shù)2、計算每毫升酵母菌懸液的細(xì)胞數(shù)。六、思考題1、根據(jù)你的體會，說明用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少