第五章 分子生物學(xué)研究方法

第五章分子生物學(xué)研究法(上)

5.1重組DNA技術(shù)回顧

5.1.1主要三大成就

1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；

2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半

保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；

3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識了遺傳信息的流動和表達。

5.1.2關(guān)鍵性實驗技術(shù)問世為重組DNA技術(shù)奠基

1、DNA分子的切割與連接技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，才使分子生物學(xué)家有了進行DNA操作的基本工具。2、載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細胞經(jīng)過氯化鈣適當(dāng)處理之后，便能吸收λ噬菌體的DNA。1972年美國斯坦福大學(xué)S.Cohen報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細胞也能攝取質(zhì)粒DNA。大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，對重組DNA技術(shù)的創(chuàng)立具有特別重要的意義。3、Southern雜交、DNA序列分析和聚合酶鏈反應(yīng)

5.1.3主要事件重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件

年份事

件

1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T.Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。1952A.D.Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。1959-1960S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達的操縱子模型。

1964

C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965

S.W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細菌的抗藥性通常由"質(zhì)粒"DNA所決定。1966

M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。1978

首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。1980美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。

1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1983

獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984

斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986

GMO首次在環(huán)境中釋放。1988

J.D.Watson出任"人類基因組計劃"首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠--"Oncomouse"。1992

歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定。2001完成第一個人類基因組全序列測定。重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique):是按照人們意愿，在體外對DNA分子進行重組,再將重組分子導(dǎo)入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA的大量拷貝?；蚩寺?genecloning)分子克隆(molecularcloning)5.1.4重組DNA技術(shù)的概念基因克隆是70年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術(shù)，可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選。"分"是指分離制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲克隆的目的DNA。分子克隆在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。5.1.5重組DNA技術(shù)的基本步驟1、四大要素

①外源基因②載體③工具酶④受體細胞

2、重組DNA技術(shù)的基本步驟

①目的基因的獲得與載體的制備②目的基因與載體DNA的連接③重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞④重組體的篩選與重組DNA的鑒定⑤克隆基因的表達及表達產(chǎn)物的檢測與分離純化重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交5.1.6重組DNA技術(shù)的意義重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝重組DNA技術(shù)縮短了進化時間重組DNA技術(shù)使人能對生物進行定向改造體外大量擴增、研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機制，從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域，這對醫(yī)學(xué)上各種疾病等病因的查明、診斷及治療具有重大意義。酶類功能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5’-OH末端末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3‘末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶Ⅲ從DNA鏈的3’末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5’末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5’或3’末端的磷酸基團5.1.7重組DNA實驗中常見的主要工具酶限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶分類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)即反相重復(fù)結(jié)構(gòu)，是

DNA分子中以某一處為軸，其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對稱的序列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口DNA連接酶:通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片斷連接成一個整體DNA分子。T4ˉDNA連接酶EcoRI連接酶T7ˉDNA連接酶目的基因的來源原核細胞真核細胞：cDNA或gDNA文庫人工合成及PCR擴增目的基因

天然DNA（染色體DNA、病毒DNA(噬菌體DNA)、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA）5.1.8重組實驗中的主要載體定義：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。5.1重組DNA技術(shù)回顧克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。5.1重組DNA技術(shù)回顧載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA；克隆載體必須是安全的。5.1重組DNA技術(shù)回顧噬菌體載體：雙鏈DNA病毒，約50kb，兩端有一個12個核苷酸5′端突出粘性末端λ噬菌體：置換型、插入型黏粒、YAC、BAC：高容量載體質(zhì)粒載體：PBR322載體、PUC質(zhì)粒載體5.1重組DNA技術(shù)回顧克隆載體所容納的外原DNA片段的大小質(zhì)粒：10kbλ噬菌體：23kb黏粒(含有cos位點的人工構(gòu)建克隆載體。cos位點是λ噬菌體頭部組裝時的識別序列，因而黏粒能包裝入λ噬菌體顆粒后感染大腸桿菌。)：45kb細菌人工染色體BAC：350kb酵母人工染色體YAC：1000kb5.1重組DNA技術(shù)回顧一個完整的基因克隆過程包括以下步驟

１.獲得待克隆的DNA片段（基因）；

２.目的基因與載體在體外連接；

３.重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；

４.篩選、鑒定陽性重組子；５.重組子的擴增與／或表達。

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程常規(guī)質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)

Plasmid獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

Plasmidchromosome

基因載體應(yīng)具備的條件：（1）有多種限制性內(nèi)切酶切點，但每種切口最好只有1個；（2）有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍白斑試驗；（3）有一定容量；（4）有相當(dāng)?shù)某緮?shù)，即每個宿主菌可能容納的最多數(shù)。

基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細胞。常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體1、質(zhì)粒是細菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。4、質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。質(zhì)粒的生物學(xué)特性5、根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達10-200個拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如PUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。

發(fā)展概況

pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。

許多實用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成?？梢娖湓唾|(zhì)粒在使用上有優(yōu)點。

pBR322p代表質(zhì)粒；“BR”代表兩位兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是實驗編號。有過百個限制性內(nèi)切酶切點，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點也多達數(shù)十個，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的基因的優(yōu)越條件。此外，pBR322DNA，被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖質(zhì)粒載體pBR322的大小為4361bp，相對分子量較小帶有一個復(fù)制起始位點，保證了該質(zhì)粒只在大腸桿菌的細胞中行使復(fù)制的功能。具有兩種抗生素抗性基因——氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增以后，每個細胞中可累積1000-3000份拷貝，該特性為重組體DNA的制備提供了極大的方便。抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp（氨芐霉素）平板Tet（四環(huán)素類抗性基因）平板pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。

它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ部分基因及其啟動子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker。

476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，表達半乳糖苷酶的α片段。

LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動子Plac和操縱基因O。

lacZ之內(nèi)是M13的多功能連接器。三個顯著特點：（1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個細胞含500-700個拷貝）。（2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα，可利用-互補原理進行藍白篩選。（3）多克隆位點區(qū)（MCS）由人工合成的多個單一酶切位點構(gòu)成。

其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進行DNA測序和體外突變等研究。λ噬菌體載體

噬菌體是比細菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細胞一樣，噬菌體侵犯細菌，也可以認(rèn)為它是細菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內(nèi)。

侵犯細菌時，只是DNA侵入，然后利用細菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式生存和繁殖。圖左示λ噬菌體在宿主內(nèi)進行獨立復(fù)制，在1個菌體內(nèi)生長出100個左右的新噬菌體，并沖破（殺死）細菌釋放出來，再度感染其它活菌，稱為裂解。

λ噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進細菌DNA里（整合），作為細菌基因的一部分，隨菌的細胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原（lysogen）。λ噬菌體的生活周期：裂解λ侵入細菌-獨立復(fù)制-裂解（沖破細胞膜）-再感染其他細菌。λ噬菌體的結(jié)構(gòu)和用途λ噬菌體線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補的12nt，感染細菌后粘端互補成雙鏈環(huán)狀。全長48531bp，含50多個基因。λ噬菌體基因大致分為4個區(qū)：

結(jié)構(gòu)區(qū)A～J19個基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū)

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調(diào)控區(qū)啟動子、終止子和N、CI基因，O-R為裂解區(qū).

λ噬菌體及其組件的應(yīng)用

λ噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長達20kb的λDNA，換入相應(yīng)長度的目的基因。

基因文庫構(gòu)建常使用λ載體；不少先進的質(zhì)粒應(yīng)用λ組件進行構(gòu)建。λ噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。誘導(dǎo)的因素可能很多，實驗室常用的是熱誘導(dǎo):

分離得到某些λ噬菌體，在低溫時（30℃）建立溶原，用高溫（420C）則出現(xiàn)裂解。這些λ噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為cIts。

λclts1857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在λclts857下游，重組體的目的基因在42℃表達，30℃不表達。這種方法稱為熱誘導(dǎo)表達，使用的是溫敏開關(guān)。λCIts857ori目的基因PL阻遏蛋白30℃下培養(yǎng)：目的基因阻遏蛋白42℃下培養(yǎng)：失活（1）粘粒（cosmid）能容納大片段（45kb）的小分子（4kb～6kb）載體。組成：質(zhì)粒復(fù)制原點，抗藥基因，多克隆位點，已連接入的λcos位點。構(gòu)建基因文庫的λ載體（2）λDNA的體外包裝是提高λ噬菌體轉(zhuǎn)染效率的有效方法在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。高效表達質(zhì)粒pBV系列質(zhì)粒

pBV221分子量小，易轉(zhuǎn)化，含有串聯(lián)的來自λ噬菌體的強啟動PL及PR，啟動子的串聯(lián)可能有相互增強作用。含有λCIts857組件，此組件可變溫誘導(dǎo)目的基因的表達。這一組件的存在，還可適當(dāng)?shù)匾种扑拗骶牡鞍酌富钚裕_到提高表達量的目的。帶有真核生物基因表達組件的質(zhì)粒

真核生物與原核生物催化轉(zhuǎn)錄、翻譯及其后修飾的酶和起始復(fù)合物的結(jié)構(gòu)不同，醫(yī)學(xué)研究需要能表達真核生物基因的表達載體。由于病毒對宿主細胞有依賴性和可整合性，真核表達組件不少來自病毒。如巨細胞病毒（CMV）啟動子，猿猴病毒SV40的組件等。酵母質(zhì)粒和大容量載體酵母是單細胞真核生物，可接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。酵母質(zhì)粒有Yip（integrate）整合型，

Yep（epi-some）附加體型，

Yrp（replication）復(fù)制型。

pYEJ001

一種以pBR322為基礎(chǔ)的酵母質(zhì)粒，兩個抗藥基因及左下方的半圓來自pBR322，右上半圓來自酵母，包括啟動子、糖代謝酶類及氯霉素抗性基因，可在大腸桿菌體系重組再轉(zhuǎn)化酵母細胞稱為穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）昆蟲桿狀病毒（baculovirus）如核型多角體病毒ACNPV，昆蟲體系的優(yōu)點是表達效率高，目的基因插入的容量相對大，使用安全等。目前在農(nóng)業(yè)基因工程上應(yīng)用較多。如攜帶殺蟲基因的病毒對農(nóng)作物進行生物防治。YAC酵母人工染色體把酵母染色體與基因復(fù)制和表達有關(guān)的主要組件都組裝在質(zhì)粒上，令質(zhì)粒行使酵母的轉(zhuǎn)錄功能和復(fù)制功能。

pYAC只以單抄本方式繁殖，所以不適用于以生產(chǎn)為目的的基因工程。主要用于人類基因組研究和巨大基因如DMD基因達Mbp（106bp）數(shù)量級基因的克隆。

基因工程的表達體系原核生物表達體系：

大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌大腸桿菌表達體系的優(yōu)點：積累了充足經(jīng)驗，有數(shù)不清的載體可供應(yīng)用；可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；操作安全，致病能力低；成本相對低得多；真核生物的基因先在原核體系上構(gòu)建克隆，稱為亞克?。╯ubclone），然后采用其它方式轉(zhuǎn)移至真核細胞上表達。缺點：原核生物載體構(gòu)建的重組體是無法進入動物細胞進行表達；沒有加工所需的酶系統(tǒng)；熱源、內(nèi)毒素不易除去；（熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)；內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組分之一）常會形成包涵體。（蛋白常常以包涵體的形式沉積于細胞內(nèi)，表現(xiàn)為無活性的不溶性聚集物）。

表達體系的發(fā)展

表達體載體宿主第一代原核生物表達體系質(zhì)粒、噬菌體細菌第二代酵母表達體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類細胞表達體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)細胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細胞、體細胞、個體

基因工程的目的是使目的基因能高效表達?；虮磉_受DNA結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)因子與核酸相互辨認(rèn)、結(jié)合等組成的表達體系的調(diào)控。

基因表達調(diào)控可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾等水平進行基因工程載體的構(gòu)建必需應(yīng)用表達調(diào)控的基本理論知識，應(yīng)用已知的調(diào)控序列進行重組、改造。核酸是帶均勻負(fù)電荷的生物大分子，在電場中向正極移動，不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。以適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持介質(zhì)，具有分子篩效應(yīng)，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大差異，達到分離的目的。此為分離、鑒定、純化核酸片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）進行染色，可直接在紫外燈下確定DNA在凝膠中的位置。5.2.1核酸凝膠電泳技術(shù)影響核酸電泳的因素：

在電場中，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定:

1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比。

2、瓊脂糖濃度

一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。3、DNA分子的構(gòu)象

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時，它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而線狀雙鏈DNA移動最慢。4、電源電壓

在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙錠用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15％。

6、離子強度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。核酸電泳常用的指示劑有兩種：⑴溴酚藍⑵二甲苯青，

DNA的瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖主要從海洋植物中提取來的，為一種聚合線性分子，一般含有多糖、蛋白質(zhì)和鹽等雜質(zhì)，雜質(zhì)的含量每個廠商和批號的產(chǎn)品不盡相同。對DNA電泳遷移率的影響也不一樣，經(jīng)化學(xué)修飾后熔點降低的瓊脂糖叫低熔點瓊脂糖，其機械強度無明顯變化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10～500bP）的分離。瓊脂糖凝膠的孔徑取決于瓊脂糖的濃度。DNA的瓊脂糖凝膠電泳DNA的聚丙烯酰胺電泳DNA的聚丙烯酰胺電泳

普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。5.2DNA基本操作技術(shù)5.2.2細菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化（transformation）

：感受態(tài)細胞（Competentcells）

：受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2等化學(xué)試劑法、點擊法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許有外源DNA的載體分子通過。所謂細菌轉(zhuǎn)化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。常用的轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)轉(zhuǎn)化（CaCl2）法電擊法

化學(xué)轉(zhuǎn)化原理：

在0℃冷凍處理時，處于CaCl2低滲溶液中的大腸桿菌細胞膨脹成球形。DNA可吸附于其表面。在短暫的熱沖擊下，細胞吸收外源DNA，然后在豐富培養(yǎng)基內(nèi)復(fù)原并增殖，表達外源基因。5.2常見的DNA操作技術(shù)P1655.2常見的DNA操作技術(shù)電擊轉(zhuǎn)化：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細胞。菌液：生長對數(shù)期場強(最大轉(zhuǎn)化效率)：12.5-15kV/cm

溫度：0-4℃

5.2常見的DNA操作技術(shù)克隆的篩選：抗生素基因。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等-互補藍白斑篩選營養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)）5.2常見的DNA操作技術(shù)-互補篩選5.2常見的DNA操作技術(shù)β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個氨基酸編碼序列的質(zhì)粒編碼β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主細胞IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上篩選藍白斑（異丙基-D硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）

乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更強的誘導(dǎo)作用。

IPTG配合使用在基因工程可作藍白斑篩選。LacZ基因編碼的半乳糖苷酶

X-gal

藍色吲哚產(chǎn)物藍白斑試驗（IPTG-Xgal試驗）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)物

ZYX

PO

ZYX

PO乳糖標(biāo)志補救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLacZ藍色化合物X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補，稱為α-互補。由α-互補而產(chǎn)生的LacZ+細菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落，因而易于識別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。

5.2.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)1985年，K.Mullis等研究成功的一種在體外快速擴增特定基因DNA序列的方法

原理：類似于天然的DNA復(fù)制過程。將待擴增的DNA片段和兩側(cè)互補的兩段寡核苷酸引物，經(jīng)過變性，退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增倍數(shù)可達2n

倍5.2常見的DNA操作技術(shù)反應(yīng)體系模板DNA：待擴增的目的片段特異性引物：人工合成的與待擴增的靶DNA兩端序列互補的寡核苷酸片段，15-30bpDNA聚合酶dNTP含有Mg2+的緩沖液5.2常見的DNA操作技術(shù)

PCR的基本反應(yīng)步驟：

1.變性：95℃，模板DNA變性為單鏈；

2.退火：50℃左右，使引物與模板DNA退火結(jié)合；

3.延伸：72℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。 上述三個步驟為一個循環(huán)，經(jīng)25-30次循環(huán)后，可將模板DNA擴增達百萬倍。5.2常見的DNA操作技術(shù)

多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA數(shù)，即兩條引物位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值是2n。PCR技術(shù)在基因克隆方面的應(yīng)用

（1）目的基因的直接克隆，（2）通過RT-PCR進行cDNA的克??；（3）制備DNA探針，進行分子檢測等。5.2常見的DNA操作技術(shù)5.2.4實時熒光定量PCR通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進行。PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

與普通PCR的區(qū)別

普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對終點產(chǎn)物進行定量分析。實時定量PCR技術(shù)：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量。

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen

特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqManSYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲線分析

SYBRGreen法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜2、TaqMan探針法

TaqMan作用機理

TaqMan法優(yōu)缺點

5.2.5基因組DNA文庫構(gòu)建

基因組DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細菌內(nèi)， 由克隆載體所攜帶的所 有基因組DNA的集合。 簡稱G－文庫。5.3RNA基本操作技術(shù)1.總RNA的提?。篟NA易遭降解，實驗要求較嚴(yán)格?？俁NA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法（TriZol）。異硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。2.mRNA的純化mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。利用mRNA的PolyA結(jié)構(gòu)，試劑盒提供一種生物素化寡聚dT引物，與PolyA雜交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的雜交體，然后利用生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合作用以鏈抗生物素-順磁顆粒（SA-PMPs）結(jié)合雜交體，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs復(fù)合物，再利用磁性吸附作用以磁性條吸附復(fù)合物中的SA-PMPs顆粒，最后利用高嚴(yán)緊度鹽溶液中分子雜交體磁性減弱，雜交體中生物素化寡聚dT引物與mRNA分離，從而純化得到mRNA。PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖cDNA的合成cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，有反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時需要引物引導(dǎo)，常用引物是oligodT。第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。5.3.4cDNA文庫定義：cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。原理：將帶poly(A)的mRNA經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，再與原核載體連接。cDNA文庫的構(gòu)建

真核生物基因組DNA十分龐大，其復(fù)雜程度是蛋白質(zhì)和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重復(fù)序列。采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個主要困難。高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時間階段的單個細胞或個體中，都只有15%左右的基因得以表達，產(chǎn)生約15000種不同的mRNA分子?？梢?，由mRNA出發(fā)的cDNA克隆，其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。構(gòu)建步驟：1、高質(zhì)量mRNA制備：純化試劑盒，生物素2、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA:反轉(zhuǎn)錄酶，olig(dt),R63、與噬菌體載體分子連接4、噬菌體的包裝cDNA第一鏈的合成

oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。缺陷：

因為逆轉(zhuǎn)錄酶無法到達mRNA分子的5’-末端，必須從3’-末端開始合成cDNA。對于大分子量的較長的mRNA分子而言，特別麻煩。隨機引物引導(dǎo)的cDNA合成法

(randomlyprimedcDNAsynthesis)：根據(jù)許多可能的序列，合成出6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，而不僅僅從3’-末端的oligo(dT)引物一處開始。cDNA第二鏈的合成1、自身引導(dǎo)合成法：單鏈cDNA的3’端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點：

在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時，會導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。S1核酸酶的純度不夠時，會偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。第二鏈cDNA的合成氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的mRNA鏈

第一鏈cDNA的3'-末端就會形成一個發(fā)夾環(huán)

合成第二鏈cDNA

S1核酸酶消化連接處

自身引導(dǎo)法合成cDNA第二鏈2、置換合成法原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈。優(yōu)點：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA雙鏈cDNA的分級分離連接前回收大于500bp的cDNA用于連接。去掉引物、接頭及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種不完整的cDNA鏈，提高文庫質(zhì)量。5、雙鏈cDNA與載體連接1）同聚物加尾：2）加接頭引入酶切位點，添加帶有限制性酶切位點的接頭是最常用的方法3）cDNA的定向插入：cDNA兩端添加不同的限制性酶切位點，雙酶切后與對應(yīng)的雙酶切載體連接末端轉(zhuǎn)移酶+dCTP末端轉(zhuǎn)移酶+dGTP載體和cDNA退火同聚物加尾法：CH3CH3CH3CH3CH3CH3接頭加接頭cDNA的定向插入

五、cDNA文庫的篩選和鑒定基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法1、表型篩選：在宿主菌中表達目的基因，使宿主產(chǎn)生新的表型或使宿主恢復(fù)其突變基因的表型來篩選目的基因。(1)抗藥性篩選:這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進行的篩選方法。(2)插入失活篩選法(3)顯色反應(yīng)選擇法(α-互補法)

將含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至可編碼β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主細胞中，可使各自無活性的片段實現(xiàn)互補，融為一體，產(chǎn)生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍色菌落，這種現(xiàn)象就稱為α-互補。2、菌落原位雜交法探針：1）同源DNA探針鄰近種屬的相應(yīng)基因2）根據(jù)氨基酸序列設(shè)計簡并探針引物：1）同源引物鄰近種屬的相應(yīng)基因2）根據(jù)氨基酸序列設(shè)計簡并引物3、PCR篩選法4、免疫篩選需制備目的基因產(chǎn)物的抗體進行篩選?；蚪MDNA文庫與cDNA文庫的比較5.4SNP的理論與應(yīng)用SNP（singlenucleotidepolymorphism）單核苷酸多態(tài)性，指基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，源于單個堿基的轉(zhuǎn)換或顛換應(yīng)用：遺傳病研究、動植物遺傳育種5.4.2SNP的檢測技術(shù)1、基因芯片技術(shù)2、分子信標(biāo)技術(shù)3、焦磷酸測序法5.5基因克隆技術(shù)1、定義2、步驟：（1）目的基因的獲得（2）形成重組體（3）導(dǎo)入寄主細胞（4）選擇和篩選5.5.1RACE技術(shù)RACE技術(shù)（rapidamplificationofcDNAends）是用于從已知cDNA片段擴增全長基因的方法，它根據(jù)已知序列設(shè)計基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴增3’端的稱為3’RACE。。已知序列cDNA的來源序列表達標(biāo)簽減法cDNA庫差式顯示基因文庫篩選5.5基因克隆技術(shù)獲得高質(zhì)量總RNA去磷酸化去掉mRNA5′帽子結(jié)構(gòu)加特異性RNA寡聚接頭合成第一條cDNA鏈5′RACE3′RACE將純化后的PCR產(chǎn)物克隆到載體DNA中，進行序列分析RACE主要操作方法5.5.2應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因cDNA差示分析法(Representationalditterenceanalysis)RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增目的基因片段。試驗對象（Tester）供試探針（Driver）4堿基切割酶處理平均長度256bp的代表群cDNAcDNA加12/24堿基接頭補平末端以24堿基的互補序列為引物進行PCRT改換新接頭D不加接頭雜交：T:D=1:100設(shè)計新接頭引物PCR指數(shù)擴增產(chǎn)物差異產(chǎn)物5.5.3基因的大規(guī)模克隆技術(shù)產(chǎn)生背景：隨著越來越多的動植物基因組全序列被測定，許多新的基因被識別，但是，這些基因的功能還是個未知數(shù)。要明確這些基因的功能，就必須將其連入到各種載體，進行蛋白質(zhì)表達、表型分析、細胞內(nèi)定位等一系列的研究。傳統(tǒng)的酶切方法不能很好的滿足這種大規(guī)?？寺〉男枰虼薎nvitrogen公司(網(wǎng)站)開發(fā)了一種高效快速的基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)——Gateway基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)。Gateway技術(shù)能夠克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統(tǒng)。這項強大的體外技術(shù)大大地簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，而同時典型的克隆效率高達95％或更高。采用Gateway技術(shù)，你能夠很容易將目的基因轉(zhuǎn)化到其它的表達系統(tǒng)中，包括哺乳動物、昆蟲、酵母和大腸桿菌來進行進一步的研究。Gateway克隆技術(shù)的優(yōu)點Gateway克隆技術(shù)在λ噬菌體特異位點重組系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進行一系列修飾、改造，提高了這一重組系統(tǒng)的效率與特異性。Gateway克隆技術(shù)主要包括TOPO反應(yīng)和BP－LR反應(yīng)。1、TOPO反應(yīng)TOPO反應(yīng)將目的基因PCR產(chǎn)物連入Entry載體Entry載體TOPO酶切PCR產(chǎn)物退火連接切去3′GTGG后使PCR產(chǎn)物以正確的方向連入Entry載體2、BP－LR反應(yīng)BP－LR反應(yīng)被用于將目的片段從Entry載體中重組入表達載體attR1和attR2位點目的載體接頭目的基因接頭attL1和attL2位點形成新的位點attB1和attB2目的基因被轉(zhuǎn)移到表達載體中重組蛋白導(dǎo)入宿主5.5.4基因的圖位克隆法所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可通過該法克隆得到。首先，通過構(gòu)建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某染色體的特定位點，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種（個體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點堿基發(fā)生突變，或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關(guān)系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標(biāo)記(Mark)，構(gòu)建分子圖譜。通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計算的，1cM（厘摩）相當(dāng)于1%的重組率。人類基因組中，1cM≈1000kb;擬南芥菜中，1cM≈290kb;小麥中，1cM≈3500kb運用隨機引物擴增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，隨機擴增的多態(tài)性DNA)。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性.5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組的研究實質(zhì)上是在細胞水平上對蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的平行分離和分析，往往要同時處理成千上萬種蛋白質(zhì)。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。5·6蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)：可視為分子生物學(xué)的大規(guī)模篩選技術(shù)，目的在于歸類細胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。5·6·1雙向電泳技術(shù)雙向電泳（twodimensionelectrophoresis，2－D）是分離混合蛋白質(zhì)最常用的方法。雙向電泳由兩部分構(gòu)成：等電聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）。該方法是依賴于蛋白質(zhì)的等電點的不同和相對分子質(zhì)量的不同而構(gòu)建的。蛋白質(zhì)組分離技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)(2DE)：又稱二維電泳，其原理是在相互垂直的兩個方向上，分別基于蛋白質(zhì)不同的等電點和分子量，運用等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)和十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)，把復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中的蛋白在二維平面上分離展開。完整的雙向凝膠電泳分析，包括樣品制備、等電聚焦、平衡轉(zhuǎn)移、SDS—PAGE、斑點染色、圖像捕捉和圖譜分析等步驟。所用儀器1、等電聚焦電泳pH>pI帶負(fù)電pH<pI帶正電pH=pI不帶電溶液蛋白質(zhì)2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）十二烷基磺酸鈉(SDS)和少量巰基乙醇蛋白質(zhì)中的多肽鏈處于伸展?fàn)顟B(tài)形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體具有相同的荷質(zhì)比具有相同的構(gòu)象蛋白質(zhì)電泳速度由質(zhì)量決定原理十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）雙向電泳5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)雙向電泳技術(shù)pH3pH10IEFSDS分子生物學(xué)中最常用的蛋白質(zhì)技術(shù)可能是蛋白質(zhì)印跡法（Westernbloting），又稱免疫印跡法（immunobloting）。原理：經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。2.蛋白質(zhì)印跡法免疫印跡法程序可分為五個部分：蛋白樣品的制備經(jīng)過SDS分離的樣品分離的蛋白轉(zhuǎn)移到膜載體上，轉(zhuǎn)移后將膜上未反應(yīng)的位點封閉起來以抑制抗體的非特異性吸附用固定在膜上的蛋白作為抗原，與對應(yīng)的非標(biāo)記抗體（一抗）結(jié)合洗去未結(jié)合的一抗，加入酶偶聯(lián)或放射性標(biāo)記的二抗，通過顯色或放射自顯影來檢測蛋白。2.用于二級抗體的檢測有以下三種：放射性標(biāo)記的抗體與酶偶聯(lián)的抗體與生物素相偶聯(lián)的抗體3.蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)中最有意義的突破是用生物質(zhì)譜鑒定電泳后分離的蛋白質(zhì)。該技術(shù)是一種超靈敏的技術(shù)，從理論上說，僅需少量樣品就可獲得誤率低于百萬分之一的結(jié)果。作業(yè)1、典型的DNA重組實驗通常包括哪些步驟？2、PCR的基本原理？3、基因工程的概念和意義4、基因組DNA文庫和cDNA文庫在構(gòu)建原理和用途上的主要區(qū)別是什么？5、基因組學(xué)的研究對象和目的是什么？主要有哪些技術(shù)和方法？

第六章分子生物學(xué)研究法(下)

基因功能研究技術(shù)6.1.1基因表達系列分析SAGE是一種以DNA序列測定為基礎(chǔ)定量分析全基因組表達模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種細胞類型或組織的基因表達信息。兩個依據(jù)。6.1.2RNA選擇性剪切RNA選擇性剪接是指用不同的剪切方式（選擇不同的剪切位點組合）從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程。選擇剪接使一個基因翻譯為多種蛋白質(zhì)序列，是基因表達多樣性的重要表現(xiàn)形式。6.1基因表達研究技術(shù)檢測方法RT-PCRcDNA以兩端特異序列設(shè)計引物觀察PCR產(chǎn)物大小是否存在差異存在差異有選擇性剪切提取不同組織的總RNA分離mRNAPCR不存在差異無選擇性剪切圖6-26.1.3原位分子雜交技術(shù)

DNA變性:

當(dāng)溶液中的DNA分子處于高溫或高pH值(13)條件下,維持雙螺旋在一起的堿基互補對就被破壞,DNA雙鏈解離成兩條單鏈,這一過程叫DNA變性。

DNA復(fù)性:

當(dāng)溫度降低至合適溫度或恢復(fù)pH值至中性，兩條裂解的單鏈按堿基互補配對原則重新形成雙鏈結(jié)構(gòu),這過程叫DNA復(fù)性,又叫DNA雜交。

核酸分子雜交：按照堿基互補配對原則，將不同來源的序列互補單鏈的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互補配對成雙鏈雜交分子，這一過程叫核酸分子雜交。

原位雜交：用核苷酸探針對特殊的核苷酸順序在其原位進行雜交,叫原位雜交?？捎糜贒NA、RNA定位研究。熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。6.1.4定點突變技術(shù)定點突變（site－directedmutagenesis）是重組DNA進化的基礎(chǔ)，該方法通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、維修表達載體、引入新的酶切位點等。體外定點突變的具體方法有三種：（1）寡聚核苷酸介導(dǎo)的定點突變；（2）雙引物法定點突變（重疊延伸技術(shù)）；（3）大引物誘變法。以上三種方法雖不同，但原理都一致。1、寡聚核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù)已知序列的環(huán)狀DNA人工合成一段引物變性模板定點突變細菌轉(zhuǎn)化延伸誘變寡核苷酸引物DNA聚合酶篩選引入突變的環(huán)狀DNA2、重疊延伸技術(shù)正向誘變引物FM反向引物R2正向引物F2反向誘變引物RM已知序列DNA模板在重疊區(qū)發(fā)生退火PCR3使用引物F2和R2擴增PCR4全長突變DNA片段形成全長雙鏈突變DNA反向互補產(chǎn)物產(chǎn)物21PCR3、大引物誘變法PCR1產(chǎn)物正向誘變引物（M）反向引物（R1）雙鏈大引物退火和野生型基因復(fù)性PCR2正向引物（F2）退火溫度PCR2>PCR1已知序列DNA模板全長突變DNA片段6.2基因敲除技術(shù)概念：基因敲除技術(shù)（geneknockout)又稱基因打靶（genetargeting）。這種技術(shù)是通過基因工程的方法將一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又稱基因敲入），然后從整體觀察實驗結(jié)果，從而推測相應(yīng)基因的功能。這種人為地把實驗動物某一種有功能的基因完全缺失的技術(shù)稱為基因敲除技術(shù)?；蚯贸夹g(shù)完全基因敲除條件型基因敲除1、完全基因敲除完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性?；驹?構(gòu)建與靶基因同源(10～15kb)的載體外顯子插有新霉素抗性基因（neor）作為正選擇的標(biāo)志皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作為負(fù)選擇體外培養(yǎng)新霉素(G418)和致死核苷類似物(GANC)作雙重篩選將重組體導(dǎo)入ES細胞存活的ES細胞圖6-10胚胎干細胞(embryonic

stem

cell,ES):是胚胎發(fā)育期的胚細胞2、條件型基因敲除

條件型基因剔除是指某一特定細胞類型或細胞發(fā)育的特定階段剔除某一特定基因的技術(shù)。常用的條件型基因敲除有：噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)酵母細胞的FLP/FRT系統(tǒng)、R/RS系統(tǒng)Cre重組酶于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫登錄號：X03453），編碼38kDa蛋白質(zhì)。是一種位點特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個34bp的LoxP位點之間的特異性重組LoxP（locusofX-overP1）位點來源于P1噬菌體，是有兩個13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：

ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT動物基因敲除技術(shù)電穿孔、顯微注射等植物基因敲除技術(shù)T-DNA插入失活技術(shù)意義：①研究基因功能②轉(zhuǎn)基因動物的制備③用于藥物篩選的動物模型④轉(zhuǎn)基因動物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物6.3.1酵母單雜交法酵母單雜交（yeastone－h(huán)ybridsystem)是一項常用于研究DNA與蛋白之間的相互作用的方法。特點：通過該方法可以識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，可在酵母細胞內(nèi)研究真核生物DNA與蛋白之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶