臨床免疫實(shí)驗(yàn)2

《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》實(shí)驗(yàn)二

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（操作一）MTT法二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（操作一）ELISA（雙夾心法）法檢測(cè)乙肝表面抗原（HBsAg）

一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

（MTT法操作一） 原理方法結(jié)果應(yīng)用MTT法——

四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法

原理：T淋巴細(xì)胞在有絲分裂原刺激下，發(fā)生有絲分裂，形成淋巴母細(xì)胞。其蛋白質(zhì)合成與DNA合成及代謝比正常細(xì)胞旺盛，活細(xì)胞線粒體中某些酶可將MTT還原為藍(lán)黑色甲臜．用ＤＭＳＯ溶解甲臜，在５７０nm處測(cè)ＯＤ值，能夠反映Ｔ淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化程度．MTT法活/增殖期的細(xì)胞線粒體能量代謝琥珀酸脫氫酶MTTMTT摻入還原甲臢顆粒formazan細(xì)胞內(nèi)/周?chē)芙鉁y(cè)OD值MTT-四甲基偶氮唑鹽絲裂原MouseHumanTBTBConA++++-PHA+-++-PWN++++/-LPS-+--SpA---+實(shí)驗(yàn)步驟無(wú)菌取1/2的脾研磨成單細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)(40×)96孔培養(yǎng)加板(三復(fù)孔)調(diào)細(xì)胞濃度1×107/ml5%CO237℃培養(yǎng)44小時(shí)加入MTT(5mg/ml)10ul/well5%CO237℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)輕輕吸去上清，加DMSO，溶解甲臜顆粒A570nmELISAplatereader實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度ConADay1Day3注意事項(xiàng):由于本實(shí)驗(yàn)需要培養(yǎng)3天，才能觀察結(jié)果。因此，在操作時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作，避免細(xì)菌污染，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。實(shí)驗(yàn)步驟：(本次課完成)1、制備脾細(xì)胞懸液1）取脾：用1000ul加樣器取5ml培養(yǎng)液放入平皿中.頸部脫臼處死小鼠，酒精消毒，無(wú)菌取脾臟，用毛玻璃片磨碎，放在平皿中，隔著紗布吸出細(xì)胞懸液放入離心管中，離心1500r/min,20min。棄去上清,加入3mlIMDM培養(yǎng)液，混勻。2）細(xì)胞計(jì)數(shù)：取0.2ml

放入一試管中,加入1.8ml細(xì)胞計(jì)數(shù)液。取20ml填充細(xì)胞計(jì)數(shù)板,顯微鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法>>。

3）調(diào)細(xì)胞濃度到5×10６/ml：如配制10mL稀釋細(xì)胞懸液:從細(xì)胞懸液中取(2000/X)mL至試管,加入培養(yǎng)液至10ml即可。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)方法l查出四個(gè)16個(gè)大方格的總細(xì)胞數(shù)(X)l算出每個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)：Y=X÷4l每個(gè)大方格的體積為V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4mll制備的細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度（A/ml)=Y×104×稀釋倍數(shù)(10)4××實(shí)驗(yàn)步驟（本次課完成）2、加板每孔加入100ml的調(diào)好的細(xì)胞懸液1-3孔(對(duì)照)加入10%FCS-IMDM100ml4-6孔加入20mg/ml的ConA100ml7-9孔加入10mg/ml的ConA100ml10-12孔加入5mg/ml的ConA100ml3、細(xì)胞培養(yǎng)：5%CO2孵箱內(nèi)37℃培養(yǎng)48h。4、MTT摻入：在終止培養(yǎng)前4小時(shí)（培養(yǎng)44小時(shí)）加入MTT(5mg/ml)10ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，至48小時(shí)終止培養(yǎng)(此步驟由實(shí)驗(yàn)小組長(zhǎng)完成)。實(shí)驗(yàn)步驟：(下次課完成)5、結(jié)果測(cè)定：棄上清，加入DMSO(100ml/孔)，振蕩溶解甲臢顆粒。充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度值。OD570nm。形態(tài)學(xué)淋巴母細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的表現(xiàn)主要有體積明顯增大，是成熟淋巴細(xì)胞的3~4倍；染色質(zhì)疏松，核仁清晰可見(jiàn)；胞漿豐富并形成空泡。根據(jù)細(xì)胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結(jié)構(gòu)以及有無(wú)核仁等特征，分別計(jì)數(shù)淋巴母細(xì)胞、過(guò)渡型母細(xì)胞和核絲分裂相細(xì)胞以及成熟的小淋巴細(xì)胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按下式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用 檢查患者細(xì)胞免疫功能估計(jì)疾病的療效及預(yù)后細(xì)胞配型抗原的檢查：移植免疫－MLR免疫藥理學(xué)：具有免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品、中草藥及生物制品衛(wèi)生毒理學(xué)的研究二、ELISA（雙夾心法）法檢測(cè)乙肝表面抗原（HBsAg）

【目的】1.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理。2.熟悉ELISA的基本類(lèi)型和用途。3.掌握用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗夾心法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】先將已知抗體包被在固相上，洗去未吸附的抗體；加入待檢標(biāo)本，充分作用后，標(biāo)本中相應(yīng)的抗原與固相上已知抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗原成分；加入已知的酶標(biāo)抗體，再洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；加底物后，酶分解底物產(chǎn)生呈色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺判定待檢標(biāo)本中抗原的量。固相載體最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。Enzyme常用的酶辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)。葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP的底物鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)四甲基聯(lián)苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色

返回>>ApplicationofELISA目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，常用來(lái)檢測(cè)機(jī)體的可溶性的抗原或抗體。敏感性高，可檢測(cè)微量的的抗體體或激素、細(xì)胞因子及粘附分子等抗原性物質(zhì)。成品的試劑盒，已廣泛用于某些臨床疾病的診斷。返回>>常用的ELISA方法直接法(DirectELISA)間接法(IndirectELISA)夾心法(SandwichELISA)直接法間接法夾心法【材料與試劑】1．材料：酶標(biāo)板（96孔）、微量加樣器、酶標(biāo)檢測(cè)儀、濕盒、水浴箱，43℃培養(yǎng)箱2．試劑：1）包被抗體：抗HBs(用包被緩沖液稀釋2ug/ml)2）酶標(biāo)抗體（HRP—抗HBs,用洗滌液稀釋1:300）3）HbsAg表面抗原（乙肝疫苗,用樣本稀釋液稀釋1600ng/ml即1.6ug/ml）4）模擬待檢樣品（HBsAg疫苗,用樣本稀釋液稀釋400ng/ml即0.4ug/ml）5）包被緩沖液pH9.6\0.05mol/L碳酸鹽緩沖液。6）洗滌液0.01MpH7.4PBS含0.1%Tween20（不含任何防腐劑）。7）封閉液：0.01mol/L、PH7.4PBS內(nèi)含1%BSA,。8）樣品稀釋液含0.25%BSA-洗滌液。9）底物緩沖液（pH5.0）0.2MNa2HPO425.75ml+0.1M檸檬酸24.25ml+30%H2O2100μl。10）底物溶液鄰苯二胺(OPD)1mg/ml溶于底物緩沖液中，臨用前配制。11）終止液2mol/LH2SO4（22ml濃H2SO4+178mldH2O）。【實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)】2.5學(xué)時(shí)，分兩次課完成?！緦?shí)驗(yàn)步驟】第一次操作，用時(shí)25分鐘1、抗體包被：用包被液將抗HBs稀釋至適當(dāng)濃度（2ug/ml），酶標(biāo)板中1~10孔每孔加100μl，11~12做空白對(duì)照（不加樣）,將反應(yīng)板移至溫盒內(nèi)，4℃放置過(guò)夜（可保存一周，下次課后續(xù)操作）。第二次操作，下次課完成，用時(shí)100分鐘2、封閉：棄去包被液，每孔加入200ul封閉液，11~12孔空白對(duì)照,置43℃溫箱20min。3、洗滌：棄去包被板孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿1~10孔，靜置1~3min后甩干，洗滌1次，于吸水紙上拍干。4、加樣：1-2、4-8每孔加樣品稀釋液100μl，3、4孔加1.6ug/mlHbsAg表面抗原，100ul/孔，自第4孔混勻后吸出100ul加入第5孔，以此方法對(duì)倍稀釋至8孔,吸出100ul棄之,9\10孔加入待檢樣品100ul/孔,輕輕振動(dòng)混勻置于43℃20min，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次1~3分鐘,拍干。5、加酶標(biāo)抗體：每孔加HRP—抗HBs100μl（空白孔不加），置于43℃20min