核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆

第五節(jié)

核移植技術(shù)與克隆技術(shù)主講人：黃竹濤2015.4.19主要內(nèi)容：細(xì)胞核移植技術(shù)

1）基本概念

2）核移植類型

3）核移植的一般操作程序

4）核移植的應(yīng)用動(dòng)物克隆1）克隆的基本原理2）影響克隆的因素3）體細(xì)胞克隆技術(shù)4）存在的問(wèn)題一、核移植技術(shù)核移植技術(shù)：利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中（同種或異種動(dòng)物的去核成熟卵細(xì)胞），使后者不經(jīng)精子穿透等有性過(guò)程即可被激活、分裂并發(fā)育,使得核供體的基因得到完全復(fù)制，從而創(chuàng)造無(wú)性雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。1-1.基本概念供體細(xì)胞核的來(lái)源體細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞核移植胚胎干細(xì)胞核移植供受體種間關(guān)系異種核移植同種核移植核移植目的生殖性克隆治療性克隆1-2.核移植類型生殖性克隆治療性克隆細(xì)胞治療組織替代器官移植1-3.哺乳動(dòng)物克隆操作技術(shù)生產(chǎn)克隆動(dòng)物的主要方法有兩種：

1）胚胎分割

2）細(xì)胞核移植（動(dòng)物克隆主要方式）

核移植克隆哺乳動(dòng)物的技術(shù)操作過(guò)程主要包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、激活、重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng)、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步驟。核移植技術(shù)的一般操作程序1)核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備在核移植操作中，細(xì)胞核供體細(xì)胞首先必須是完整的二倍體，該細(xì)胞必須保持有供體動(dòng)物完整的基因組；其次，供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細(xì)胞分化過(guò)程的倒轉(zhuǎn)，變得如同剛剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個(gè)正常動(dòng)物個(gè)體的全過(guò)程。

供體細(xì)胞主要有兩大類：胚胎卵裂球和體細(xì)胞。另外，核供體細(xì)胞的來(lái)源還有胚胎干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。

2)核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備

去核卵母細(xì)胞常常作為核移植的受體細(xì)胞這是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達(dá)程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細(xì)胞重新回到發(fā)育過(guò)程的原點(diǎn)，同受精卵一樣開(kāi)始個(gè)體發(fā)育過(guò)程。

卵母細(xì)胞的來(lái)源有兩種方式：一是用激素對(duì)雌體進(jìn)行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的MⅡ卵母細(xì)胞。二是從屠宰場(chǎng)收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。去核方法：

1）Hochest染色法

2）時(shí)間控制去核法

3）化學(xué)去核法

4）2.5%蔗糖處理去核

5）末期去核法6）盲吸去核法3)細(xì)胞核移植

常用的核移植方法有兩種，即胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射是用一個(gè)外徑5～8μm的注核針吸取供體核后直接注射進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的方法。透明帶下注射則是把供體細(xì)胞核注射在透明帶與卵母細(xì)胞之間的卵周隙中，核移植后用電刺激進(jìn)行細(xì)胞融合。4）細(xì)胞核融合經(jīng)透明帶下細(xì)胞核移植操作的卵子需要進(jìn)行融合處理，才能使供體核進(jìn)入受體胞質(zhì)中，形成重構(gòu)卵。

方法：化學(xué)融合——聚乙二醇處理仙臺(tái)病毒融合電融合——外加脈沖電場(chǎng)5)激活卵母細(xì)胞的激活涉及的因素很多，無(wú)論是受精引起的卵母細(xì)胞激活還是人工的激活，都會(huì)引起卵母細(xì)胞發(fā)生一系列的反應(yīng)，這些反應(yīng)是胚胎發(fā)育所必需的。其激活原理是通過(guò)電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細(xì)胞從MII期中解放出來(lái)，并轉(zhuǎn)到“受精”的狀態(tài)。電激法化學(xué)試劑法6）重組胚的體外培養(yǎng)

經(jīng)融合和激活的重組胚體外培養(yǎng)，觀察重組胚的發(fā)育率。

7）胚胎移植

重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強(qiáng)、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進(jìn)行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。1-4.核移植技術(shù)的應(yīng)用異種器官移植

可移植器官短缺豬的器官大小、結(jié)構(gòu)和功能上與人體器官相近

急性免疫排斥反應(yīng)基因敲除半乳糖基轉(zhuǎn)移酶核移植基因敲除SPF克隆豬器官移植生產(chǎn)藥用蛋白目的基因

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系核移植動(dòng)物乳腺

乳液提取目的產(chǎn)

物基因打靶

保護(hù)瀕危物種細(xì)胞核去核卵母細(xì)胞核移植重構(gòu)胚1)成功率低2)理論研究相對(duì)滯后3)體細(xì)胞克隆后代可能出現(xiàn)早衰，老化4)技術(shù)不夠完善1-5.核移植技術(shù)存在的問(wèn)題2-1.克隆基本概念與原理

2-1.克隆基本概念與原理發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。經(jīng)過(guò)核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過(guò)有性生殖過(guò)程，而是通過(guò)核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)，就叫做動(dòng)物克隆。2-2.影響哺乳動(dòng)物克隆效果因素1.供受體細(xì)胞的同期處理2.受體細(xì)胞的因素

3.供體細(xì)胞的因素

4.重構(gòu)胚激活因素、懷孕及其維持1.供受體細(xì)胞的同期處理M期（分裂期）：噻氨酯達(dá)唑或乙酰甲基秋水仙堿；G1期（DNA復(fù)制前期）：抑制DNA合成的藥物，如：阿菲迪霉素、羥基脲；G2期（DNA復(fù)制期）：放線菌酮；G0期誘導(dǎo)：血清饑餓法。

細(xì)胞周期對(duì)核移植成功率的影響至關(guān)重要?！岸嗬颉闭Q生以后，其研究者認(rèn)為，成功的關(guān)鍵因素之一是供體細(xì)胞經(jīng)血清饑餓后，處于GO期，認(rèn)為這種細(xì)胞易于重編程。

G0期：指具有分裂能力的組織中的細(xì)胞在反復(fù)分裂數(shù)次之后，處于停止分裂狀態(tài)的時(shí)期。供受體細(xì)胞所處的時(shí)期：對(duì)于受體細(xì)胞而言，其所處的階段對(duì)核移植后重構(gòu)胚的發(fā)育至關(guān)重要；對(duì)于供體細(xì)胞而言，不同動(dòng)物不同時(shí)期的胚胎具有不同的分化潛能，但是，如果核供體超過(guò)囊胚階段，則會(huì)影響重組胚的發(fā)育，如果超過(guò)了囊胚后期，則更多的細(xì)胞會(huì)發(fā)生不可逆的分化。

2.供體細(xì)胞核選擇的因素：（1）細(xì)胞類型：

KatoY等比較了牛同一個(gè)體卵母細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞及不同個(gè)體體細(xì)胞：肝細(xì)胞、耳細(xì)胞、子宮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞及卵母細(xì)胞對(duì)克隆效果的影響，結(jié)果認(rèn)為牛卵丘／顆粒細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞最適用于牛的核移植。（2）細(xì)胞傳代次數(shù)：細(xì)胞的傳代是否利于克隆個(gè)體方面的說(shuō)法不一。但是大多數(shù)研究者使用的是原代培養(yǎng)或短期培養(yǎng)的細(xì)胞，認(rèn)為這類細(xì)胞利于核移植胚的發(fā)育。

3.受體細(xì)胞的因素：

（1）盲吸去核法通常，盲吸法去核的時(shí)間選擇在第一極體剛排出時(shí)，因隨時(shí)間延長(zhǎng)卵細(xì)胞核遠(yuǎn)離第一極體，影響去核效率。此外，不同動(dòng)物卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，其盲吸法的去核效率也不同。

（2）化學(xué)誘導(dǎo)去核法與盲吸法等建立在顯微操作系統(tǒng)基礎(chǔ)之上的機(jī)械去核法相比，化學(xué)去核法程序簡(jiǎn)單、機(jī)械損傷小、胞質(zhì)丟失少、重復(fù)性好、適合大規(guī)模卵母細(xì)胞去核，具有很樂(lè)觀的應(yīng)用前景。

卵母細(xì)胞要求完全去核，否則會(huì)形成多倍體影響發(fā)育。（3）MPF的作用

MPF（促卵成熟因子）是通過(guò)卵成熟誘發(fā)物質(zhì)的作用在卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)所產(chǎn)生的因子，可促使卵核胞破壞實(shí)現(xiàn)卵成熟過(guò)程。將正在成熟的卵細(xì)胞質(zhì)注射到未成熟的卵時(shí)，可看到被注射的卵被誘發(fā)成熟。通過(guò)卵成熟誘發(fā)物質(zhì)所產(chǎn)生的少量促卵成熟因子在卵內(nèi)廣泛增加，在到達(dá)一定濃度時(shí)，便引起卵母細(xì)胞成熟。卵細(xì)胞質(zhì)中促卵成熟因子不具有特異性，所以可認(rèn)為是普遍的細(xì)胞分裂開(kāi)始的重要因子。卵母細(xì)胞的活化程度將影響胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，只有完全活化才能發(fā)育。

4.重構(gòu)胚激活因素、懷孕及其維持：重構(gòu)胚的激活是體細(xì)胞克隆技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，體細(xì)胞克隆胚胎的充分激活是保證胚胎正常發(fā)育的先決條件，只有在去核卵母細(xì)胞充分激活的情況下才可以指導(dǎo)移人的核發(fā)生重編程。

可以通過(guò)將重組胚放在結(jié)扎羊的輸卵管中培育一段時(shí)間的方法，或者在體外將其與輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)的的方法來(lái)促使其激活并發(fā)育。注意移植重組胚的時(shí)間及維持其妊娠。生物學(xué)意義：1)提高動(dòng)物無(wú)性繁殖能力：擴(kuò)大優(yōu)良品種，挽救瀕危物種。2）促進(jìn)對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)與遺傳關(guān)系的研究3）探索控制腫瘤細(xì)胞和癌細(xì)胞核的活動(dòng)機(jī)理：研究其基因調(diào)控，為治療提供依據(jù)。4）生物制藥：活體藥物工廠。CattleGoatsMicePigsGaurCatSheep1996199819981996200120002001克隆動(dòng)物照片HorseDeerMulesRatsDog20032003200520032003體細(xì)胞克隆牛理論問(wèn)題分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過(guò)程）的機(jī)理還不清楚；克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡。克隆動(dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基因。在克隆過(guò)程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問(wèn)題還沒(méi)有解決。2-3.克隆技術(shù)存在的問(wèn)題實(shí)踐問(wèn)題克隆動(dòng)