分子生物學(xué)人類基因組DNA提取等

人類基因組DNA提取限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用人類基因組DNA提取原理：DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象。

為了進(jìn)行測(cè)序、雜交和基因的表達(dá)，獲得高分子量和高純度的DNA是非常重要的前提。

哺乳動(dòng)物的一切有核細(xì)胞都可以用來(lái)制備DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾組織是最常用的材料。原始材料較少或較難獲得時(shí)（如羊水細(xì)胞），還必須經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)獲得足夠量的細(xì)胞；有時(shí)為了簡(jiǎn)便易行起見(jiàn)，還可以無(wú)創(chuàng)傷地采集材料，如用口腔上皮脫落細(xì)胞、發(fā)根細(xì)胞。根據(jù)材料來(lái)源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似。

制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長(zhǎng)度不小于100-200kb。一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。

這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。一.材料

一份提取總DNA的細(xì)胞或組織1.5ml、

微量離心管、微量移液器與吸頭、15ml離心管、錐形瓶（500或1000ml）。二.設(shè)備

離心機(jī)、電子天平、恒溫水浴箱、紫外分光光度計(jì)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、微波爐或沸水浴、透射紫外燈。儀器與試劑三.試劑1.細(xì)胞核裂解液(STE)：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA2.0.8%（W/V）標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖；3.0.5×TBE緩沖液4.其他試劑：TE緩沖液或重蒸餾水、氯仿/異戊醇（24:1，V/V）、異丙醇或無(wú)水乙醇、電泳加樣緩沖液、溴化乙錠（EB）實(shí)驗(yàn)材料1.生理鹽水2.1×細(xì)胞核裂解液（SET）：0.5ml

2mol/LTris-HClpH8.2，10ml

4mol/LNaCl，0.4ml

2mmol/LEDTA，加蒸餾水至100ml3.10%SDS：SDS10g，加水至100ml4.20mg/ml蛋白酶K5.Tris-飽和酚6.氯仿7.無(wú)水乙醇8.TE（緩沖系統(tǒng)）：10mol/LTris-HCl(PH8.0)，1mol/LEDTA(PH8.0)1.EDTA：鈣離子絡(luò)合劑，在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中是二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶，降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；2.SDS（十二烷基硫酸鈉）：是一種去污劑，破壞細(xì)

胞膜的脂質(zhì)膜；3.蛋白酶K：一種很強(qiáng)的蛋白水解酶，能消化各種蛋白

質(zhì)（包括糖蛋白和肽類）及脂類和胺類物質(zhì)，但糖

蛋白的降解物常與DNA一同沉淀下來(lái)，干擾酶的活

性，消化后需要用酚、氯仿抽提純化；4.酚：使蛋白質(zhì)變性，將變性的蛋白質(zhì)溶解在其中；5.氯仿：一種有效的蛋白變性劑，能促進(jìn)兩相的分離。DNA提取原則1.保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性2.純化后不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的物質(zhì)3.排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染4.蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度5.排除其他核酸分子的污染四、操作步驟（酚法抽提染色體DNA）（一）DNA的提取

1.采集口腔粘膜脫落細(xì)胞，用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，用分泌出的唾液反復(fù)漱口；將唾液吐到杯中。用生理鹽水洗滌，12000r/min離心10分鐘，倒掉上清；重復(fù)1次。2.沉淀中加1ml1×細(xì)胞核裂解液(STE)，混勻，再加350mlSTE和150ml10%SDS，搖勻，至出現(xiàn)粘稠透明狀。加10ml20mg/ml蛋白酶K，搖勻。37℃溫箱過(guò)夜或50℃3～4小時(shí)。3.加等體積飽和酚，輕搖混勻10分鐘，室溫12000r/min離心10分鐘，去除蛋白和SDS的沉淀。4.小心移上清至另一離心管，加等體積氯仿混勻5分鐘，室溫12000r/min離心5分鐘。5.小心移上清，若上清不清亮透明，則用等體積氯仿再抽提一次。6.將上清移入另一離心管中，沿離心管壁向DNA溶液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，搖勻，靜置10min，12000r/min離心10分鐘，用新配制的70%乙醇洗兩次，室溫干燥5分鐘，再將DNA溶于20-100mlTE緩沖液中，測(cè)OD（吸光度）值。7.TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求長(zhǎng)期保存，則需加2倍體積無(wú)水乙醇置于70℃保存。電泳鑒定

取樣品1μl、電泳緩沖液5μl、6×加樣緩沖液1μl（含溴酚藍(lán)和二甲苯青FF指示劑及甘油），混勻，在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行水平板微型電泳，用噬菌體λDNA作為標(biāo)準(zhǔn)。

DNA區(qū)帶應(yīng)比較集中，泳動(dòng)速度與λDNA

相同或稍慢，證明分子量均>50kb。一般見(jiàn)不到泳動(dòng)速度比溴酚藍(lán)快的RNA區(qū)帶。如果DNA不成區(qū)帶，而是散開分布在λDNA與溴酚藍(lán)之間，則說(shuō)明DNA已經(jīng)被降解成小分子。基因組DNA提取的意義基因組DNA含有細(xì)胞中全部的遺傳信息，提取DNA是遺傳性疾病，胎兒產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)傷診斷，腫瘤和傳染性疾病早期確診的重要手段和技術(shù)。DNA提取的質(zhì)量和產(chǎn)量直接影響PCR擴(kuò)增，分子克隆，限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)是否成功。限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別及切割位點(diǎn)

限制性核酸內(nèi)切酶只能識(shí)別特殊的堿基序列，作用于切斷相鄰堿基之間的磷酸二酯鍵；通常切割4～6個(gè)堿基對(duì)、具有回文序列的DNA片段，大多數(shù)酶是錯(cuò)位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生5ˊ或3ˊ黏性末端。

如EcoRⅠ切割后產(chǎn)生5ˊ黏性末端：

5’GAATTC3’3’CTTAAG5’

AATTC3’G5’

5’

G3’CTTAA

5’5’

結(jié)果有兩種情況：1.暴露出一段堿基序列，我們稱之為粘性末端，如EcoRⅠ切割后產(chǎn)生5ˊ黏性末端。2.有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生平端或鈍端,如SmaⅠ5?-CCCGGG-3?5?-CCCGGG-3?3?-GGGCCC-5?3?-GGGCCC-5?瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同，電泳速度有差異而分離，這種技術(shù)是基因操作中常用的一種方法。

與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用（1）適合分離大片段DNA。

瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝