分子熒光光譜法(去磷光)

1第二章分子熒光光譜法MolecularFluorescenceSpectrometry2

分子熒光光譜是一種發(fā)射光譜分析方法。分子熒光光譜法

分子吸收能量后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)通常是不穩(wěn)定的，會(huì)釋放能量而產(chǎn)生躍遷回到基態(tài)，如果是以光輻射的形式釋放能量，就稱為發(fā)光。相應(yīng)的光譜分析法就稱為分子發(fā)射光譜法。分子熒光是一種光致發(fā)光過程。日本富山海邊的熒光烏賊用產(chǎn)生不同顏色熒光蛋白的細(xì)菌創(chuàng)作的圖畫

熒光棒4分子熒光光譜法2.1分子熒光的產(chǎn)生過程2.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜2.3影響熒光強(qiáng)度的因素2.4分子熒光光譜儀2.5分子熒光光譜法的應(yīng)用5

由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光的產(chǎn)生機(jī)理。1.分子能級(jí)與躍遷

分子能級(jí)的每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；

2.1分子熒光的產(chǎn)生過程基態(tài)→激發(fā)態(tài)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；62.電子激發(fā)態(tài)的多重度2.1分子熒光的產(chǎn)生過程單重態(tài)：與基態(tài)中的電子自旋方向相反，壽命較短.三重態(tài)：與基態(tài)中的電子自旋方向相同，壽命較長(zhǎng)7

基態(tài)——S0第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)

——S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)

——T1、T2…

；2.1分子熒光的產(chǎn)生過程8

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量的過程；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛預(yù)無輻射躍遷2.1分子熒光的產(chǎn)生過程2.分子的去激發(fā)過程9S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫2.1分子熒光的產(chǎn)生過程103.分子的去激發(fā)形式2.1分子熒光的產(chǎn)生過程振動(dòng)馳豫

同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至相鄰低振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。

發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12

S

。

見Jablonski能級(jí)圖113.分子的去激發(fā)過程2.1分子熒光的產(chǎn)生過程內(nèi)轉(zhuǎn)換

同多重度電子能級(jí)中（如S2→S1，T2→T1）,等能級(jí)間的無輻射能級(jí)交換。

見Jablonski能級(jí)圖內(nèi)轉(zhuǎn)換發(fā)生的時(shí)間約在10-12

S。

通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。123.分子的去激發(fā)過程2.1分子熒光的產(chǎn)生過程外轉(zhuǎn)換

激發(fā)態(tài)分子與溶劑和其他溶質(zhì)分子間的相互作用及能量轉(zhuǎn)移的非輻射躍遷。外轉(zhuǎn)換使發(fā)光強(qiáng)度減弱或消失，這種現(xiàn)象稱為“猝滅”或“熄滅”。

見Jablonski能級(jí)圖133.分子的去激發(fā)過程系間跨躍不同多重態(tài)之間如（S1→T1）的一種無輻射躍遷。見Jablonski能級(jí)圖該過程是激發(fā)態(tài)電子改變其自旋態(tài)，分子的多重性發(fā)生變化的結(jié)果。即單重態(tài)到三重態(tài)的躍遷。當(dāng)兩種能態(tài)的振動(dòng)能級(jí)重迭時(shí)，這種躍遷的幾率增大。

即較低單重態(tài)振動(dòng)能級(jí)與較高的三重態(tài)振動(dòng)能級(jí)重疊。這種躍遷是“禁阻”的。

2.1分子熒光的產(chǎn)生過程143.分子的去激發(fā)過程熒光發(fā)射

激發(fā)態(tài)分子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)S1回到基態(tài)S0伴隨的光輻射稱為熒光。熒光發(fā)射是相同多重態(tài)間的躍遷，幾率較大，速度很快，10-7～10-9s,見Jablonski能級(jí)圖S04321S143212.1分子熒光的產(chǎn)生過程153.分子的去激發(fā)過程磷光發(fā)射激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)（T1）的最低振動(dòng)能級(jí)上返回基態(tài)S0伴隨的光輻射稱為磷光發(fā)射。磷光發(fā)射是不同多重態(tài)之間的躍遷（即T1→S0）。故屬于“禁阻”躍遷，因此磷光的輻射速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于熒光，約為10-4到10-5s。所以，將激發(fā)光從磷光樣品移走后，還?？捎^察到后發(fā)光現(xiàn)象。而熒光發(fā)射卻觀察不到該現(xiàn)象。

見Jablonski能級(jí)圖2.1分子熒光的產(chǎn)生過程16熒光激發(fā)光譜，簡(jiǎn)稱激發(fā)光譜，測(cè)量化合物發(fā)射的某一固定波長(zhǎng)的熒光的強(qiáng)度（選最大發(fā)射波長(zhǎng)）與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線；1.熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜曲線在光輻射的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射出不同波長(zhǎng)的熒光。

激發(fā)光譜反映了在某一固定的發(fā)射波長(zhǎng)下，不同激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)的熒光的相對(duì)效率。2.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜17激發(fā)光譜固定em=620nm(MAX)ex=290nm

(MAX)固定發(fā)射波長(zhǎng)(em)

掃描激發(fā)波長(zhǎng)(ex)熒光激發(fā)光譜與紫外-可見吸收光譜類似2.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜18B.熒光發(fā)射光譜，又稱熒光光譜,固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線。2.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜發(fā)射光譜反映了在相同的激發(fā)條件下，不同波長(zhǎng)處分子熒光的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度。19ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)發(fā)射光譜(熒光光譜)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)2.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)(ex)掃描發(fā)射波長(zhǎng)(em)

20212.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

在溶液中，熒光光譜顯示了某些普遍的特征。為我們識(shí)別熒光物質(zhì)的正常熒光提供了基本原則。3.熒光光譜的特征(1).Stokes位移

在溶液中，分子的熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是比其相應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)。這種波長(zhǎng)位移現(xiàn)象是1852年Stokes首次觀察到的。222.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

熒光總是從最低激發(fā)單重態(tài)回到基態(tài)時(shí)所發(fā)射的輻射，而激發(fā)過程有可能將分子激發(fā)到高的振動(dòng)能級(jí)或更高的電子能級(jí)上去。

振動(dòng)、熱輻射等使分子失去能量。即激發(fā)與發(fā)射熒光間的能量損失是斯托克斯位移產(chǎn)生的主要原因。

其他如溶劑效應(yīng)、激發(fā)態(tài)分子的反應(yīng)也會(huì)引起斯托克斯位移。232.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(2).鏡像對(duì)稱規(guī)則

分子的熒光發(fā)射光譜與其激發(fā)光譜之間存在著鏡像關(guān)系。激發(fā)光譜發(fā)射光譜242.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

鏡像對(duì)稱規(guī)則的產(chǎn)生，是由于:

大多激發(fā)光譜的形狀表明了分子的第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)，

而熒光發(fā)射光譜則表明了分子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)。

S04321S1432125S04321S14321

一般情況下，分子的基態(tài)和第一激發(fā)單線態(tài)的振動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)類似，因此激發(fā)光譜的形狀與熒光發(fā)射光譜的形狀呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。2.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜262.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜3.熒光光譜的特征

(3).發(fā)射光譜不變形

或者說熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。

一般地，用不同激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)熒光分子，可以觀察到形狀相同的熒光發(fā)射光譜。

這是由于熒光分子無論被激發(fā)到哪一個(gè)激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子經(jīng)振動(dòng)弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換等過程后，最終回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

27S04321S14321

分子的熒光發(fā)射總是從第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)上（S1→S0）。

所以熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。2.2熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜28292.3影響熒光強(qiáng)度的因素分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：①分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光；②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。302.3.1熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率：

也稱為熒光效率或量子效率，表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力。

可以定義為物質(zhì)吸光后發(fā)射的熒光的光子數(shù)與吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。31

返回基態(tài)速率強(qiáng)熒光物質(zhì)：熒光發(fā)射>無輻射躍遷大

低熒光物質(zhì)：無輻射躍遷>發(fā)射熒光小

因此，熒光量子效率與熒光發(fā)射過程的速率及無輻射過程的速率有關(guān)。2.3.1熒光量子產(chǎn)率32

式中，kf

是熒光發(fā)射過程的速度常數(shù)，

ki

是系間跨躍和外轉(zhuǎn)換等有關(guān)無輻射躍遷過程的速率常數(shù)。

一般而言，

kf

主要取決于分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而ki

主要取決于化學(xué)環(huán)境。

分子結(jié)構(gòu)

發(fā)光分子所處的環(huán)境因此，影響物質(zhì)熒光強(qiáng)度的因素主要有兩個(gè)：2.3.1熒光量子產(chǎn)率332.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素

一般地，具有強(qiáng)熒光的分子都具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)，同時(shí)，給電子取代基，剛性的平面結(jié)構(gòu)均有利于熒光的發(fā)射。

因此，分子中至少具有一個(gè)芳環(huán)或具有多個(gè)共軛雙鍵的有機(jī)化合物才容易發(fā)射熒光，而飽和的或只有孤立雙鍵的化合物，不呈現(xiàn)顯著的熒光。

結(jié)構(gòu)對(duì)分子熒光的影響主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1.分子結(jié)構(gòu)342.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素(1)共軛效應(yīng)

產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。352.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素(2)結(jié)構(gòu)剛性效應(yīng)

可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。

實(shí)驗(yàn)表明，具有剛性結(jié)構(gòu)的分子容易產(chǎn)生熒光。若熒光染料吸附在固體表面上，由于固體表面提供的附加剛性，也會(huì)使熒光增強(qiáng)。362.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素芴聯(lián)苯f=1.0f=0.237偶氮苯雜氮菲382.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素

此外，分子的這種平面剛性結(jié)構(gòu)效應(yīng)對(duì)許多金屬配合物的熒光發(fā)射也有影響。

如:

8-羥基喹啉本身的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)比其鋅配合物低。

利用這種性質(zhì)可進(jìn)行痕量金屬離子的測(cè)定。392.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素(3)取代基效應(yīng)給電子基團(tuán)，如

-NH2、-OH、-OCH3、-NHCH3和

-N（CH3）2等，使熒光增強(qiáng)；原因：產(chǎn)生了p-共軛作用，增強(qiáng)了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。402.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素(3)取代基效應(yīng)

吸電子基團(tuán)，如

-Cl、-Br、-I、-NHCOCH3、-NO2和

-COOH等，使熒光減弱。

原因：n→π*躍遷的摩爾吸光系數(shù)、量子產(chǎn)率均低于π→π*躍遷。π→π*躍遷是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。41小結(jié)：強(qiáng)熒光的有機(jī)化合物具備下特征:①大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)；②剛性的平面結(jié)構(gòu)；③取代基團(tuán)為給電子取代基。2.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素422.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素

(1)

溶劑效應(yīng)

溶劑對(duì)熒光光譜的影響主要是由于溶液的介電常數(shù)和折射率等因素的作用，這稱為一般溶劑效應(yīng)，這種效應(yīng)是普遍存在的。

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；

一般地，增大溶劑的極性，光譜紅移。這是由于π→π＊躍遷的能量減小，從而使熒光光譜向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。2.環(huán)境因素432.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素

(2)

溫度的影響

一般地，隨溫度降低，溶液中熒光物質(zhì)的量子效率和熒光強(qiáng)度將增大，并伴隨光譜的藍(lán)移。原因：溫度降低，介質(zhì)的粘度增大，溶劑的馳豫作用大大減小。溫度升高，碰撞頻率增加，外轉(zhuǎn)換的去激發(fā)幾率增加。

因此，選擇低溫條件下進(jìn)行熒光檢測(cè)將有利于提高分析的靈敏度。442.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素(3)

pH的影響

對(duì)于含有酸性或堿性基團(tuán)的熒光物質(zhì)而言，溶液的pH將對(duì)這類物質(zhì)的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生較大的影響。

因此在熒光測(cè)量中往往需要控制溶液的pH值。pH<5無熒光5~12藍(lán)色熒光>12無熒光

苯胺陽(yáng)離子

苯胺分子

苯胺陰離子452.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素

(4)

散射光的影響

瑞利(Reyleigh)散射光—光子和物質(zhì)分子碰撞時(shí)，未發(fā)生能量交換，僅運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變，波長(zhǎng)與入射光波長(zhǎng)相近，由溶劑、容器、膠體等散射引起

—選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，由單色器消除溶劑的拉曼（Raman）光散射—光子和物質(zhì)分子碰撞時(shí)，運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變，同時(shí)發(fā)生能量交換，波長(zhǎng)與熒光波長(zhǎng)相近，隨激發(fā)光改變而改變，由空白溶劑產(chǎn)生。

—采用波長(zhǎng)較短的激發(fā)光可避免干擾。

462.3.2影響熒光強(qiáng)度的因素

(5)

熒光猝滅

熒光分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子之間相互作用，使熒光強(qiáng)度減弱的作用稱為熒光猝滅。包括碰撞猝滅、氧的猝滅、濃度（自）猝滅和自吸收等。

能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。

472.4分子熒光光譜儀熒光光譜儀是由光源，激發(fā)單色器，樣品池，發(fā)射單色器，檢測(cè)器及記錄系統(tǒng)等組成。光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器482.4分子熒光光譜儀

光源發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)單色器分光后得到特定波長(zhǎng)激發(fā)光，入射到樣品使熒光物質(zhì)激發(fā)產(chǎn)生熒光，通常在90度方向上進(jìn)行熒光測(cè)量。光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器

發(fā)射單色器與激發(fā)單色器互成直角。經(jīng)發(fā)射單色器分光后使熒光達(dá)到檢測(cè)器而被檢測(cè)。49熒光分光光度計(jì)工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖問題：熒光分光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器2.4分子熒光光譜儀50紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器2.4分子熒光光譜儀51二.光源1.光源的要求：發(fā)射強(qiáng)度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強(qiáng)度隨波長(zhǎng)的變化小有足夠長(zhǎng)的使用壽命2.4分子熒光光譜儀52常用氣體放電燈類型：

氙燈光源高壓汞光源2.4分子熒光光譜儀53三.單色器激發(fā)單色器

用于熒光激發(fā)光譜的掃描及選擇激發(fā)波長(zhǎng)；發(fā)射單色器

用于掃描熒光發(fā)射光譜及分離熒光發(fā)射波長(zhǎng)。2.4分子熒光光譜儀54五.樣品池問題：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池與熒光分光光度計(jì)的樣品池有什么區(qū)別？四.檢測(cè)器光電倍增管電荷偶合元件檢測(cè)器

2.4分子熒光光譜儀55紫外-可見分光光度計(jì)

測(cè)量池(吸收池)熒光分光光度計(jì)樣品池I0ItI0ItIF,p1.材料：紫外-可見分光光度計(jì)——石英池、玻璃池?zé)晒夥止夤舛扔?jì)——石英池

2.形狀：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池——兩面透光熒光分光光度計(jì)的樣品池——四面透光562.5分子熒光光譜法的應(yīng)用

分子熒光光譜法具有高的靈敏度和好的選擇性。

熒光分析法的應(yīng)用廣泛，可測(cè)定60余種元素，尤其適合對(duì)生物大分子的檢測(cè)。

此外，還可作為高效液相色譜及毛細(xì)管電泳的檢測(cè)器。572.5分子熒光光譜法的應(yīng)用（1）熒光強(qiáng)度與濃度的基本關(guān)系式1.熒光定量分析光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)為：P13958熒光強(qiáng)度（IF）與吸收的激發(fā)光的光強(qiáng)及量子產(chǎn)率成正比：按照級(jí)數(shù)展開式：2.5分子熒光光譜法的應(yīng)用59對(duì)于稀溶液，當(dāng)bc<0.02時(shí)：IF----熒光強(qiáng)度F-----熒光量子產(chǎn)率b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質(zhì)濃度當(dāng)I0一定時(shí)，2.5分子熒光光譜法的應(yīng)用60

低濃度時(shí)，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，高濃度時(shí)，由于自熄滅和自吸收等原因，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度不呈線性關(guān)系2.5分子熒光光譜法的應(yīng)用

與紫外－可見分光光度法相比，其靈敏度可高出2－4個(gè)數(shù)量級(jí)，其檢測(cè)下限通常可達(dá)0.1～0.001

gcm-3。

原因？612.5分子熒光光譜法的應(yīng)用（2）單組分的熒光測(cè)定直接測(cè)定法：適用于有熒光的物質(zhì)間接測(cè)定法：適用于不發(fā)生熒光，或熒光量子效率很低物質(zhì)。利用化學(xué)反應(yīng)使非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒馕镔|(zhì)；例：甾族化合物，經(jīng)濃H2SO4處理后，使不產(chǎn)生熒光的環(huán)狀醇類結(jié)構(gòu)改變?yōu)槟墚a(chǎn)生熒光的酚類結(jié)構(gòu)。熒光猝滅法，若被測(cè)物質(zhì)具有熒光猝滅劑的作用，可測(cè)量熒光強(qiáng)度的降低來測(cè)定該熒光物質(zhì)的濃度。例：硼砂對(duì)姜黃素的熒光強(qiáng)度有顯著的淬滅作用，可用于測(cè)定食品中的硼砂。

622.5分子熒光光譜法的應(yīng)用無機(jī)化合物

利用金屬離子，如鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂及某些稀土元素等，與有機(jī)試劑形成熒光配合物來進(jìn)行熒光分析。有機(jī)化合物

熒光分析可測(cè)定許多類有機(jī)化合物，在臨床、生物化學(xué)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中十分重要。632.5分子熒光光譜法的應(yīng)用幾種常用的熒光試劑試劑測(cè)定的元素安息香B,Zn,Ge,Si2,2’-二羥基偶氮苯Al,F,Mg2-羥基-3-萘甲酸Al,Be8-羥基喹啉Al,Be芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)化合物熒光測(cè)定的主要類型。待測(cè)物試劑λexmaxλemmax測(cè)定范圍ppm丙三醇苯胺紫外藍(lán)色0.1~2糠醛蒽酮4655051.5~15氨基酸氧化酶3154250.01~50維生素A無水乙醇3454900~20蛋白質(zhì)曙紅丫紫外5400.06~6腎上腺素乙二胺4205250.001~0.02

青霉素α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮雜蒽4205000.0625~0.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.001~0.033胍基丁胺鄰苯二醛3654700.05~5四氧嘧啶苯二胺36548510-4652.5分子熒光光譜法的應(yīng)用（2）單組分的熒光測(cè)定

定量方法可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

首先測(cè)定一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度—濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)量試樣的熒光強(qiáng)度，從而求得其濃度。1.熒光定量分析662.5分子熒光光譜法的應(yīng)用（3）多組分的熒光測(cè)定

利用熒光物質(zhì)本身具有的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，實(shí)驗(yàn)時(shí)可以選擇任一波長(zhǎng)來進(jìn)行多組分的熒光測(cè)定。

若二組分的熒光光譜峰不重疊，可選用不同的發(fā)射波長(zhǎng)來測(cè)定各組分的熒光強(qiáng)度；

若二組分的