第八章微生物代謝組學

第八章微生物代謝組學（Microbialmetabolomics）及代謝產物庫（MicrobialMetabolitesLibraries）微生物代謝組學是指全面分析(定性和定量)細胞生長或生產周期某一時刻細胞內和細胞周圍的所有低分子量代謝物.從生物量培養(yǎng)、滅活和代謝產物的提取到代謝物的定量分析分析范圍(nmol-mmol)、化學功能各異的代謝產物目的：揭示正常狀態(tài)及內外環(huán)境變化后代謝過程動態(tài)反應規(guī)律。一、微生物代謝組學代謝組學(metabolomics)是一種研究生物樣品中所有小分子代謝物的技術，是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后出現的一門新學科，已成為系統(tǒng)生物學的重要組成部分。代謝組學是通過考察生物體系受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后)所有小分子代謝產物隨時空的變化情況，來研究生物體系的代謝途徑的一種技術。代謝組學與其它組學的研究對象的最大區(qū)別是其研究代謝組的變化。代謝組的變化是生物對遺傳變異、疾病以及環(huán)境影響的最終應答。代謝組學的突破在于將傳統(tǒng)的代謝途徑擴展為代謝網絡的研究代謝組學所解決的問題非常復雜：如大腸桿菌的全部代謝產物僅占細胞干重的3%～5%,但化學結構和生物活性的多樣性難以估計,是一般合成化合物和組合化學產物所不能比擬的,其范圍從小的無機離子到疏水性的脂質及復雜的天然產物,濃度范圍跨越9個數量級(從pmol

到mmol)。研究內容包括代謝組學：定性和定量特定條件下生物樣品內的全部代謝物。然而,由于代謝物組成復雜、含量不一，樣品制備過程的偏差,以及檢測設備的量程及通量等問題，目前還難以分析全部的代謝物。目標代謝物分析(metabolitetargetanalysis)

：利用特定方法研究難分析化合物(difficultanalytes)如植物激素等。代謝譜分析(metaboliteprofiling)：檢測胞外代謝物代謝指紋分析(metabolicfingerprinting)：對粗提代謝物進行高通量的定性分析，通過譜型比較將樣品進行快速分類，尋找差異峰，揭示生物對疾病或有毒物應答的生物標記物代謝產物組學(metabonomics)：多指以核磁共振(NMR)手段研究與疾病相關的代謝物，是綜合地研究某一時間點對細胞內全部代謝物的影響代謝組學的特點：1、能夠對各類代謝產物實現高通量分析測定2、上游基因、蛋白層面變化能在下游代謝產物中放大3、代謝產物整體變化可直接反應機體狀態(tài)（一）、微生物代謝組學是系統(tǒng)生物學的重要組成部分共同譯解其全部基因功能，它綜合了分析化學、基因組學以及信息科學的最新進展,在功能基因組研究中居于核心地位Catalyst,metabolome,proteome,phenotype

Thesystemsbiologyframeworkrepresentation隨著基因組學研究的深入,功能基因組開始研究基因組、轉錄組以及蛋白組的數據與表型之間的關系；而細胞內的全部代謝物最接近于表型,從而產生了研究全部代謝物的要求,代謝組(metabolome)的概念由此誕生Metabolicfootprintingcanresultinimportantbiologicalinformation.Differentyeaststrains(a),bydirectinjectionmassspectrometry(DIMS)(b).furtheranalysedbystatisticaltechniques(c),suchasprincipalcomponentsanalysis(PCA),Discriminantanalysis(d)canthenbeusedtocreateanewvariablebycombiningtheoriginalvariablesinsuchawaythatthedifferencesbetweenthepredefinedgroupsaremaximized,resultingininformationonbiologicalfunctions(e).Classificationofdifferentapproachesofmetabolomicsinvestigationswithrespecttocomprehensionandmetabolitelocalisation（二）、分析過程代謝組學研究的技術平臺一般流程包括樣品制備、代謝產物的檢測和分析鑒定、數據分析與模型建立Quenched(急劇冷卻)Workflowforquantitativemicrobialmetabolomeanalysisusingmultiplecomprehensiveanalyticalmethods.IS,internalstandard.代謝組學研究流程Warehousing(入庫)Fig.1Flowdiagramofsamplingprocedure,metabolicactivityquenching,intracellularmetaboliteextraction(endometabolome),extracellularmetabolite(exometabolome)andanalysisproceduresforquantificationsimultaneous(同時發(fā)生的)１、樣品制備微生物代謝物樣品的制備一般分為微生物培養(yǎng)、淬滅和代謝產物的提取生物量培養(yǎng)技術1)特殊生長速率(μ)2)通過固定特殊生產速率，可固定其他通量,如特殊底物攝取速率(Qs)、O2

攝取速率(OUR)和CO2轉化速率(CER)。3)可以加上一個特殊的生長限制介質組分，如碳源。4)容易完成和再現生理參考穩(wěn)態(tài)條件微生物代謝組學研究要求微生物的生長條件是可以控制和重復的。在一個生物反應器中，需要嚴格控制溫度、pH、培養(yǎng)基組成、溶解氧和二氧化碳等，以明確界定生長條件，建立標準的和可重復的參考培養(yǎng)條件滅活及菌體的獲得滅活的目的是讓細胞內的酶失活,導致代謝物的輪廓“凍結”。傳統(tǒng)的代謝產物活性快速滅活方式：樣品溫度的瞬間改變至低溫(-40℃)或高溫(>80℃)，或應用極端pH的高堿(氫氧化鈉或氫氧化鉀)或高酸(高氯酸、鹽酸或三氯乙酸)完成的。液氮滅活法：把樣品直接投入液氮，冰上解凍后收集菌體細胞內代謝產物的提取提取步驟應遵循的原則是:以適當的回收率從細胞中提取最大量的代謝產物。2)代謝產物不應該遭遇任何物理和化學修飾,降解應控制在最小范圍內;3)防止代謝產物丟失和非破壞性。２、代謝產物的分析鑒定傳統(tǒng)的酶法定量胞內外代謝物只能分析一個樣品中的一個或幾個代謝物，且需要的樣品體積大。而胞內代謝物濃度一般很低，在淬滅或提取過程中又會被稀釋，所得的樣品體積一般很少，這些都將嚴重影響酶法定量的可靠性代謝組學定量胞內外代謝物的分析方法要求具有高靈敏度、高通量和無偏向性的特點。(GC-MS)、液相色譜與質譜聯用(LC-MS)、毛細管電泳與質譜聯用（CE-MS）以及核磁共振(NMR)目前，應用最廣泛、最有效的技術是氣相色譜2質譜(GC-2MS)和液相色譜2質譜(LC-2MS)。這兩種技術可以檢測包括糖、糖醇、有機酸、氨基酸、脂肪酸以及大量次級代謝物在內的數百種化合物。GC-2MS具有較高的分辨率和靈敏度LC-2MS具有強大的分離能力，廣泛應用于難揮發(fā)性物質的分析Full-scanGC-MSchromatogramofamicrobialsamplederivatizedbyoximationandsubsequentsylilation(unpublisheddata)３、數據分析與模型建立從檢測到的代謝產物信息中進行兩類(如基因突變前后的響應)或多類(如不同表型間代謝產物)的判別分類以及生物標記物的發(fā)現色譜、質譜、核磁共振技術及它們的聯用技術是代謝物組學研究中最重要的研究手段，而且這些技術還在向高通量，高靈敏度，高解析度和高可靠性得到大量的多維的數據，這對它們的分析產生很大的困難，因此需用各種模式識別技術來進行簡化數據復雜程度并從中找出顯著性因素，進而通過進行代謝網絡建模或重建及分析來解釋得到的結果，以指導菌種改進、植物育種、藥物開發(fā)及基因治療等代謝組學原始數據的解析可分為如下3個基本步驟:(1)提取出色譜分離(如GC2MS)后未能有效分開的代謝物峰并得出其相應濃度(2)根據其保留時間及質譜圖等信息鑒別有效峰所代表的化合物(3)根據代謝數據建立代謝網絡模型。已經開發(fā)出界面友好的公開軟件，如Sumner等開發(fā)的MSFACTS(metabolomicsspectralformatting,alignmentandconversiontools)，可以輸入如GC2MS原始數據，輸出代謝物清單。解決該問題應該更多地依賴于一些新的算法進行自動推算，而不是尋找相應的標準參照物。代謝組學應用領域(1)植物功能基因組研究,主要以擬南芥為研究模型,也包括一些轉基因作物的研究.(2)疾病診斷,根據代謝物指紋圖譜診斷腫瘤、糖尿病等疾病(3)制藥業(yè),主要通過高通量比對預測藥物的毒性和有效性,通過全面分析來發(fā)現新的生物指示劑(4)微生物領域(5)毒理學研究,包括利用代謝組學平臺研究環(huán)境毒理及藥物毒理(6)食品及營養(yǎng)學,即研究食品中進入體內的營養(yǎng)成分及其與體內代謝物的相互作用代謝組學可研究尿液、血樣、植物提取物及微生物樣品，NovakBJ等采集I型糖尿病患者呼出氣體進行分析，找到了與I型糖尿有很強特異性相關聯的生物標志物硝酸甲酯可用于診斷在疾病分型、藥物毒性評價、植物基因功能和表型的研究等取得了進展（三）代謝組學在微生物領域的應用１、微生物分類,突變體篩選以及功能基因研究某些菌株按照基因型與表型兩類方法分類會得出不同的結果代謝譜分析方法(metabolicprofiling)異軍突起,逐漸成為一種快速、高通量,全面的表型分類方法。采用代謝組分類時,可以通過檢測胞外代謝物來加以鑒別。常用的胞外代謝物檢測方法為樣品衍生化后進行GC-2MS分析、薄層層析或HPLC-2MS分析,最后通過特征峰比對進行分類Bundy等采用NMR分析代謝譜成功地區(qū)分開臨床病理來源以及實驗室來源的不同桿菌(bacilluscereus)２、發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化需要檢測大量的參數,利用代謝組學研究工具可以減少實驗數量,提高檢測通量,并有助于揭示發(fā)酵過程的生化網絡機制,從而有利于理性優(yōu)化工藝過程在接觸葡萄糖底物后的15～25s范圍內,大腸桿菌體內發(fā)生的葡萄糖代謝物變化與經典生化途徑相符,但隨后的過程則與經典途徑不符,推測可能存在新的未知調控步驟。３、環(huán)境微生物研究微生物降解是環(huán)境中去除污染物的主要途徑深入了解污染物在微生物內的代謝途徑,將有助于人們優(yōu)化生物降解的條件,從而實現快速的生物修復根際(rhizosphere)空間在植物-微生物相互作用中發(fā)揮著重要的作用。Narasimhan等利用根際代謝物組(rhizosphere

metabolomics)方法,闡釋了植物分泌物對根際微生物降解多氯代酚(PCB)的作用機制。二、微生物代謝產物庫（MicrobialMetabolitesLibraries）微生物是活性天然產物的重要來源,微生物代謝物具有極大的化學結構多樣性和復雜性建立微生物代謝物庫對藥物高通量篩選、發(fā)現先導化合物有極其重要意義代謝產物庫是進行高通量篩選的先決條件,包括數據庫管理系統(tǒng)、主要從微生物樣品中提取的活性部位或單體化合物和少量合成化合物1、預分離代謝物庫將800種菌株的培養(yǎng)液過濾,得到培養(yǎng)液的濾液和菌絲體兩部分濾液部分經不同吸附性色譜柱處理得到800種強極性組分和6400種中等極性的組分菌絲體部分用有機溶劑提取得到800種菌絲體提取物采用半制備高效液相對以上3部分組分進一步細分得到至少80000種純度大于85%的天然化合物最后,對化合物庫中活性成分進行液相質譜、核磁共振分析,排除重復性物質。采用該方法從發(fā)現苗頭化合物到完成結構鑒定所需時間短菌種來源多樣性的地域如深地層、深海及極端溫度、鹽度及pH值的地點往往可分離得到新的微生物,為發(fā)現新的化合物提供了可能Mincer

報道由一種新型放線菌屬Salinospora

可分離得到強抗癌活性物質SalinosporamideA培養(yǎng)基成分微生物產生次級代謝物的種類和產量受到培養(yǎng)基成分和生長條件影響。如:改變培養(yǎng)基中的氮源可使真菌抑制劑Cancidas

的天然前體Pneumocandins

產量提高10～20倍。因此改變微生物生長條件來提高菌種代謝產率成為許多制藥公司經常使用的策略代謝物分離和檢測方法2、純天然產物庫AnalyticonDiscovery和AventisPharmaAG兩公司合作在18個月內建成一個純度大于80%、包含2242種微生物來源化合物及1758種植物來源化合物的無重復結構純天然產物庫3、合成及半合成天然產物庫隨著高通量有機合成在藥物發(fā)現過程中的應用,多種設計方法被用于化合物庫的構建,其中包括:通過全合成獲得天然產物衍生物庫、天然產物類似物庫,及由天然產物而來的化合物庫等思考題或討論：1、微生物代謝產物組學與基因組學、轉錄組和蛋白質組學之間的聯系與區(qū)別？2、微生物代謝組學的研究方法有哪些？3、如何建立微生物代謝產物庫？4、建立代謝產物庫有何意義？參考文獻ValeriaMapelli1,2,LisbethOl