人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性與研究,醫(yī)學(xué)工程論文

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性與研究,醫(yī)學(xué)工程論文羊膜位于胎盤的最內(nèi)層，主要來歷源于外胚層的上皮細(xì)胞和來源于中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。其不含血管，細(xì)胞成分相對簡單，在胎兒娩出后即成為廢棄物.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞〔humanamnioticmesenchymalstemcells,hAMSCs〕有著來源豐富、無需有創(chuàng)操作、取材幾乎不受限制、分離培養(yǎng)方式方法簡便、有向3個胚層來源的組織細(xì)胞分化的潛能、免疫原性低等多種優(yōu)點，可能成為一種愈加理想的間充質(zhì)干細(xì)胞〔mesenchymalstemcells,MSC〕臨床研究及應(yīng)用的來源[1].1hAMSCs的生物學(xué)特性1.1免疫表型及基因表示出當(dāng)前，hAMSCs還沒有統(tǒng)一的外表標(biāo)志物，但是大多數(shù)外表抗原和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞〔bonemarrowmesenchymalstemcells,BM-MSCs〕類似。Kim等[2]通過分離羊膜間充質(zhì)細(xì)胞并在體外擴增至第2、3代后獲得成纖維樣細(xì)胞，通過不同的培養(yǎng)條件分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞。免疫表型分析結(jié)果顯示，其表示出SSEA-3、SSEA-4、膠原蛋白-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ、-Ⅳ、-Ⅻ、纖維連接蛋白、-SMA、波形蛋白〔Vimenti〕、結(jié)蛋白、細(xì)胞角蛋18〔CK18〕、HCAM-1、成纖維細(xì)胞外表蛋白和人類白細(xì)胞抗原〔HLA〕-ABC;弱表示出ICAM-1蛋白；不表示出TRA-1-60、VCAM-1、vWF、PECAM-1和HLA-DR.用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響〔RT-PCR〕方式方法檢測發(fā)現(xiàn)無論傳至幾代，一些基因[如：Oct-4、Rex-1、SCF、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子〔nervecellularadhesionmo1ecul,NCAM〕、巢蛋白〔Nestin〕、骨形態(tài)發(fā)生蛋白〔bonemorphoge-neticprotein,BMP〕4、心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、肝細(xì)胞核因子〔hepatocyteneclearfactor,HNF〕-4、波形蛋白〔Vimen-ti〕、CK18]始終持續(xù)表示出。而一些基因〔如：鼠短尾突變體表型、FGF-5、Pax-6和BMP2〕不表示出。華而不實，研究發(fā)現(xiàn)，-甲胎蛋白、HLA-ABC、HLA-DR基因表示出于早期〔2~3代〕的細(xì)胞中而不表示出于晚期〔7~13代〕的細(xì)胞中，且在第3代以上的細(xì)胞中可檢測出端粒酶活性。近年來，流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞側(cè)群技術(shù)廣泛應(yīng)用于提取多分化潛能干細(xì)胞。樸正福等利用流式細(xì)胞分選技術(shù)hAMSCs中分離提純干細(xì)胞〔hAMC-SP細(xì)胞〕，通過FACS分析結(jié)果示，此細(xì)胞表示出Nestin、Vimentin、整合素家族成員〔CD49b、CD49c、CD49d、CD49e〕、CD9、CDl3、CDl9、CD29、CD44、CD46、CD51、CD59、CDl66及干細(xì)胞相關(guān)的Oct-3/4抗原。HLA-ABC、TRA-1-81及SSEA-4為弱表示出；CD34、CD45、CDll7、CD56、CD90、CDl05、CDl06、CDl33、Fit1、Musashil及HLA-DR無陽性結(jié)果，TRA-1-60及SSEA-3也表示出陰性。實驗結(jié)果提示此細(xì)胞與其他間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，不表示出造血干細(xì)胞標(biāo)記，表示出整合素分子成員及間充質(zhì)干細(xì)胞特征性外表標(biāo)志蛋白。1.2增殖能力、免疫原性及致瘤性SSEA-3、SSEA-4是胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞的外表標(biāo)志特征，成體干細(xì)胞包括BMMSCs無表示出。研究發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)細(xì)胞表示出SSEA-3、SSEA-4,講明AM-MSCs可能是介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的一個中間等級的干細(xì)胞，因而，其增殖能力比BM-MSCs更強。同時發(fā)現(xiàn)傳至〔14.50.9〕代、培養(yǎng)〔146.88.9〕d后、群體培增平均數(shù)〔36.94.7〕后細(xì)胞衰老.人羊膜細(xì)胞的低免疫原性和人羊膜組織移植不易引起免疫排擠反響。有學(xué)者通過實驗發(fā)現(xiàn)將AM-MSCs與人外周血單個核細(xì)胞〔PBMC〕或純化的T細(xì)胞直接transwell共培養(yǎng)都能夠抑制同種異體混合淋巴細(xì)胞反響誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，隨著AM-MSCs細(xì)胞的增加，其抑制效應(yīng)越明顯，當(dāng)細(xì)胞比例到達(dá)l∶l時，抑制效應(yīng)最強。近來有學(xué)者進(jìn)一步研究表示清楚hAM-SCs通過分泌可溶性因子在抑制淋巴細(xì)胞增殖中起作用，華而不實前列腺素可能是關(guān)鍵的效應(yīng)分子。并且初次證實了hAMSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力是其本身所具有的，而不是像BM-MSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖需要活化刺激等條件.近來研究報道，采用原代或第1~3代的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行治療，不會有致瘤的危險。而當(dāng)前對于hAMSCs的致瘤性問題，國內(nèi)外的研究均較少。樸正福等通過在體外進(jìn)行癌化實驗，提示hAMSCs傳代培養(yǎng)時保持細(xì)胞原有的特性，不具有致瘤性。利用體外細(xì)胞集落分析方式方法對hAMSCs的致瘤性進(jìn)行了簡單的研究，發(fā)現(xiàn)AMC-SP細(xì)胞未構(gòu)成集落，而作為陽性對照的HepG2構(gòu)成了多數(shù)較大集落。2hAMSCs的臨床前研究干細(xì)胞是具有自我更新、高度增殖和多系分化能力的細(xì)胞群體，是替代、修復(fù)或加強受損或衰老組織、器官功能的理想種子細(xì)胞，是組織工程再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要生物材料來源。hAMSCs能分化為多種細(xì)胞，且因其本身的眾多優(yōu)勢，使其在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有很高的應(yīng)用價值。近年來已有不少學(xué)者對其做了很多臨床前的探尋求索研究。有研究證實羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)人臍血單個核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞擴增，擴增后兩者在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中能夠構(gòu)成造血祖細(xì)胞集落，其造血支持作用與BM-MSCs類似，二者比擬差異無統(tǒng)計學(xué)意義.近期有學(xué)者初次使用hAMSCs移植治療大劑量順鉑誘導(dǎo)的骨髓抑制，發(fā)現(xiàn)hAMSCs移植治療較早地改善順鉑所致骨髓抑制小鼠的造血功能[7].Kim等[8]發(fā)現(xiàn)hAMSCs較脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表示出更高層次水平的血管內(nèi)皮生長因子-A、血管生成素-1、肝細(xì)胞生長因子、纖維母細(xì)胞生長因子-2〔FGF-2〕，十分是抗凋亡因子〔Akt-1〕也在hAMSCs中高表示出。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)移植hAMSCs入小鼠缺血性后肢中，觀察到其自發(fā)的構(gòu)成血管樣構(gòu)造以及表示出特定的內(nèi)皮基因和蛋白。移植hAMSCs后加強血液灌注及毛細(xì)血管密度，表示清楚hAMSCs能增加新血管構(gòu)成，且實驗證實其移植率高。以上講明移植hAMSCs在治療缺血性下肢中可能具有可觀的療效。Warrier等[9]采用實時熒光PCR〔RT-PCR〕、免疫組織化學(xué)法等方式方法顯示羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外有生成內(nèi)皮和血管的能力。進(jìn)一步研究證實其本身表示出促血管生成因子〔如：Tie2、Ang1、VEGF、VEGFR、vWF、KDR和Flt4〕。這表示清楚可將其應(yīng)用于創(chuàng)傷愈合、中風(fēng)、缺血性疾病和組織修復(fù)中。Kim等[10]和Fatimah等[11]采用糖尿病的NOD/SCID小鼠模型，也證實了羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌血管新生因子和加強移植分化能力，促進(jìn)傷口愈合。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)連續(xù)傳代培養(yǎng)后羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對血管生成素-1的表示出加強。因胎兒的創(chuàng)傷愈合需要最小的炎性反響和有限的疤痕，Klein等采用胎羊羔模型發(fā)現(xiàn)，雖hAMSCs不是創(chuàng)傷愈合經(jīng)過中絕對必需的，但其能加快創(chuàng)傷閉合，增加傷口處的細(xì)胞外基質(zhì)。而對華而不實轉(zhuǎn)化的影響還需進(jìn)一步研究。近來有研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs在體外經(jīng)自然生物誘導(dǎo)劑RPE〔老鼠再生胰腺提取物〕誘導(dǎo)可分化為分泌胰島素的細(xì)胞.也有學(xué)者通過實驗觀察到羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能構(gòu)成胰島樣細(xì)胞團(tuán)〔ILC〕，采用免疫組織化學(xué)法顯示已分化的ILC可表示出人胰島素、胰高血糖素、生長抑素。而實時定量PCR顯示除表示出人胰島素、胰高血糖素、生長抑素，還表示出Ngn3、Isl1.將其移植入實驗性糖尿病小鼠，可使小鼠恢復(fù)正常的血糖且沒有免疫排擠.以上講明羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有構(gòu)成新生胰島的能力，使其可能用于細(xì)胞替代治療糖尿病。hAMSCs也能分化為神經(jīng)元細(xì)胞。有研究證實將經(jīng)BHA誘導(dǎo)的hAMSCs移植入小鼠局灶缺血模型〔此模型有不同程度的左側(cè)偏癱伴隨右側(cè)霍納氏綜合征〕，分別于1、3、6、8周后檢查，發(fā)現(xiàn)與對照組比擬，移植組小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)異常感覺和狀態(tài)有明顯的改善。且移植入小鼠體內(nèi)的hAMSCs主要集中于移植部位及其周邊區(qū)域，而在某些特定的情況下，其向缺血部位遷移。未檢測到缺血部位的膠質(zhì)增生及淋巴細(xì)胞浸潤。以上實驗講明，用BHA誘導(dǎo)過的hAMSCs能分化為表示出NSE的神經(jīng)元樣細(xì)胞。除此之外，hAMSCs移植可能改善局灶性腦缺血后造成的神經(jīng)系統(tǒng)異常感覺和狀態(tài).近來以大鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs能顯著改善腦缺血大鼠的行為障礙、減少腦梗死體積及提高功能恢復(fù)。將hAMSCs移植入阿爾茨海默病老鼠中，發(fā)現(xiàn)其通過免疫調(diào)節(jié)及旁分泌機制持久地改善了老鼠的記憶功能.Paracchini等研究發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞有可能分化為與囊胞性纖維癥〔CF〕發(fā)病相關(guān)的器官〔肝與肺〕的上皮細(xì)胞，并能有助于部分修復(fù)CF的表型。有研究表示清楚，hAMSCs能分化為心肌細(xì)胞，且能高效率地重組成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞〔MiPSCs〕,由MiPSCs分化得來的心肌細(xì)胞表示出c-kit細(xì)胞的外表標(biāo)志，其能純化心肌細(xì)胞群且能用于同種異體的心臟干細(xì)胞療法.近期研究發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)系統(tǒng)能增加hAMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，使其能更有效地應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué).還有學(xué)者通過將羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞直接移植入心肌梗死的NOD/SCID小鼠模型中的缺血心肌組織的周邊，發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能顯著表示出相關(guān)的趨化因子及其受體，并改善了心臟功能，這一試驗表示清楚了將羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于缺血性心血管病的治療的可能性.有學(xué)者建立有氣管缺陷的胎兒羊羔模型，發(fā)現(xiàn)移植羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能增加其氣管的修復(fù)，表示清楚了將來應(yīng)用于圍產(chǎn)期兒氣道修復(fù)的可能性.在博來霉素誘發(fā)的肺損傷活體模型中研究中發(fā)現(xiàn)，hAMSC能減輕肺纖維化、炎性反響，以及恢復(fù)肺的通氣功能。近來有學(xué)者用載有hAMSCs的羊膜直接移植到有皮膚傷口的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其通過促進(jìn)表皮干細(xì)胞和毛細(xì)血管的再生促進(jìn)皮膚愈合.也有學(xué)者用hAMSCs與hAECs細(xì)胞構(gòu)建雙層膜構(gòu)造的皮膚組織，發(fā)現(xiàn)其與人皮膚組織有類似的形態(tài)，擁有表皮和真皮，且能成功修復(fù)無胸腺小鼠的全層皮膚缺損[22].在移植hAMSCs入四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝硬化模型中實驗中，發(fā)現(xiàn)其能減少肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，改善肝的纖維化[23].這為臨床提供了一種治療肝纖維化疾病的新方式方法。Lange-Consiglio等[24]初次比擬了羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞與BM-MSCs在治療馬的肌腱、韌帶損傷的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的療效優(yōu)于BM-MSCs.還有學(xué)者研究證實BM-MSCs的一些治療應(yīng)用可被羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞等其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞所取代，包括移植物抗宿主病的治療[25].Han等[26]通過流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)表示出于女性生殖系統(tǒng)及妊娠子宮中的HOXA9、HOXA10、HOXA11基因也表示出于羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞上，并通過相關(guān)實驗推斷其可能作為子宮干細(xì)胞療法的新來源。Sakuragawa等發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表示出神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞的表型。近期又有研究證實hAMSCs有可能應(yīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療。3瞻望hAMSCs具有取材方便、來源廣泛、不易受污染