感受態(tài)細(xì)胞的制備及大腸埃希菌轉(zhuǎn)化

感受態(tài)細(xì)胞的制備及大腸埃希菌的轉(zhuǎn)化中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。

轉(zhuǎn)化特指在基因克隆技術(shù)中將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。

載體是基因克隆中的重要運(yùn)載工具，它們是通過改造天然質(zhì)粒、噬菌體和病毒等構(gòu)建的，其中質(zhì)粒是分子克隆中最常用的載體之一。

質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的一種雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子，能利用細(xì)菌染色體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的同一套酶系統(tǒng)，在細(xì)菌體內(nèi)獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌處于0℃、CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹形成球形，DNA形成不易被DNase降解的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)菌表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理（熱休克），細(xì)胞可以吸收附于細(xì)胞表面的DNA復(fù)合物。然后在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，球狀細(xì)胞得到復(fù)原并分裂增殖，其中被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，質(zhì)粒DNA得到復(fù)制，抗生素抗性基因得到表達(dá)，隨后，將培養(yǎng)物接種在含有抗生素的瓊脂平板上，只有被轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌才能在平板上生長，經(jīng)過12~16小時(shí)培養(yǎng)，可生成肉眼可見的菌落。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理

分子量相對較小，3-10kb，能在細(xì)菌中穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)--松馳型質(zhì)粒。具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于對宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。如抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因等。具有多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)--MCS。便于外源基因的插入。質(zhì)粒載體的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理對載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制。不存在特異的內(nèi)切酶體系降解載體DNA。在載體增殖過程中，不對載體DNA進(jìn)行修飾。

不產(chǎn)生載體DNA的體內(nèi)重組。

易導(dǎo)入重組DNA分子。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞具備特點(diǎn):實(shí)驗(yàn)原理原核細(xì)胞主要是大腸桿菌、鏈霉菌及枯草桿菌等，常用的為大腸桿菌。真核細(xì)胞包括酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞等。宿主細(xì)胞外源DNA沒有明顯的遺傳標(biāo)志，若直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，無有效方法區(qū)分導(dǎo)入和未導(dǎo)入外源DNA的細(xì)胞。外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，能否在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制并長期保存及其分離純化是問題，因此，必須有一個(gè)能在該宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我重制和表達(dá)的載體來攜帶外源DNA。實(shí)驗(yàn)原理為何要將外源DNA與載體連接后，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞？實(shí)驗(yàn)步驟一、感受態(tài)細(xì)胞的制備（從第4步開始）1.從菌種保存管中挑取一環(huán)細(xì)菌（大腸桿菌DH5α），接種于不含抗生素（Amp）的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜（12~16h）。2.挑取單個(gè)克隆轉(zhuǎn)入10mlLB液體培養(yǎng)基中（不含Amp），37℃200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜（12~16h）。3.將10ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入200mlLB液體培養(yǎng)基中（不含Amp），37℃200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)4h左右，使其OD600值為0.4~0.6（約為5×107細(xì)胞/ml），于冰上冷卻至0℃。4.取1.5ml培養(yǎng)物置于1.5mlEP管中，5000rpm離心3min，棄上清，收集沉淀。5.以700μl冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液（0.22μm濾器過濾）重懸細(xì)菌，冰浴30min。6.5000rpm離心3min，棄上清，收集沉淀。7.將細(xì)胞重懸于100μl冰預(yù)冷的含10%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液中，-80℃凍存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)步驟二、轉(zhuǎn)化1.將制備的感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，使其自然解凍。5μl質(zhì)粒DNA（約50ng）加入1管感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻。2．致敏：冰浴20min。3．熱休克：42℃水浴中45－90s，冰浴2min。4．鋪板混合物制備：向上述管內(nèi)加入500μl無抗生素LB液體培養(yǎng)基，37℃200rpm水平勻速振蕩培養(yǎng)40－60分鐘。5．鋪板：將玻棒彎制的三角推子在酒精燈上充分燒灼（2－3分鐘，然后充分冷卻3－5分鐘）；將培養(yǎng)的鋪板混合物顛倒重懸，取100μl置平板中央，用冷卻的推子均勻涂布在含抗生素的固體LB培養(yǎng)基上。6．室溫放置10分鐘，倒置，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。7．次日下午，挑取單個(gè)菌落（單克隆菌落）轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，可用于保種、質(zhì)粒DNA提取及其他操作。結(jié)果分析極少或無菌落假陽性克隆衛(wèi)星菌落影響轉(zhuǎn)化效率的因素

1.感受態(tài)細(xì)菌的基因型：Crp-（能特異影響轉(zhuǎn)化效率的基因）基因型的轉(zhuǎn)化效率要比Crp+基因型的感受態(tài)高出很多。2.菌株的生長條件：從-70℃冰箱中細(xì)菌保種管中取出的細(xì)菌直接劃平板，再轉(zhuǎn)至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所制備的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率最高。致敏前，應(yīng)收獲對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌進(jìn)行感受態(tài)的制備（OD600值為0.3~0.4）。3.玻璃和塑料器皿的清潔度：痕量去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大地降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率，因此，所用的物品均必須清洗干凈并進(jìn)行高壓滅菌。影響轉(zhuǎn)化效率的因素

4.轉(zhuǎn)化緩沖液：⑴試劑的純度：尤其是CaCl2，務(wù)必使用能夠得到的最高質(zhì)量的試劑（以進(jìn)口試劑為最佳），分裝成小份，4℃避光保存。⑵pH值：pH>8或pH<4時(shí)，得不到任何轉(zhuǎn)化子，pH4~8時(shí)，轉(zhuǎn)化效率呈鐘形曲線，峰值約為6.4~6.8，中性或偏弱酸性。⑶陽離子：二價(jià)陽離子，常見：Mg2＋、Mn2+、Ca2+、Zn2+、Co2+等Mg2＋、Mn2+、Ca2+：低濃度時(shí)十分有效⑷凍存保護(hù)劑：10%甘油。使細(xì)胞在凍存過程中防止冰晶的形成而損傷細(xì)胞活性，但甘油可使轉(zhuǎn)化效率降低約30%。5~7%DMSO。能使轉(zhuǎn)化效率提高，但需在液N2中保存。5．轉(zhuǎn)化步驟DNA量、冰浴時(shí)間、熱沖擊時(shí)間、復(fù)蘇時(shí)間6．質(zhì)粒分子量大?。?~7.3kb，轉(zhuǎn)化效率基本一致。7．其它因素：玻璃管、LB培養(yǎng)基、體系中的T4DNA連接酶8．注意操作，防止雜菌污染。問題及解決方法

極少或無菌落⑴感受態(tài)細(xì)胞失活：感受態(tài)細(xì)胞只能在-70℃保存數(shù)月，轉(zhuǎn)化效率隨保存時(shí)間延長而下降?？芍匦轮苽涓惺軕B(tài)細(xì)胞。⑵DNA量：過少或過多，均可導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的下降。⑶DNA體積：過大，不能超過感受態(tài)細(xì)胞總體積的10%。⑷DNA片段連接不成功：①T4DNA連接酶及反應(yīng)緩沖液失活：少量分裝后，-20℃保存。因?yàn)榉磸?fù)多次凍融或貯存于4℃會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)緩沖液中的ATP降解；②載體末端與插入片段末端之間難以連接；③使用了錯(cuò)誤的限制性核酸內(nèi)切酶，或在設(shè)計(jì)引物時(shí)限制性核酸內(nèi)切酶的序列方向?qū)懛?，?dǎo)致酶切不成功。⑸抗生素：使用錯(cuò)誤的抗生素，或抗生素的濃度過高。問題及解決方法

假陽性克?、乓詥蚊盖械妮d體，去磷酸化不夠，載體自身環(huán)化效率過高。⑵瓊脂平板上的抗生素失活或含量過低：可直接將無DNA轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞鋪于平板上，看是否有菌落生長。若有，則表示抗生素失活或含量過低。⑶載體DNA與插入片段的分子比率過高，導(dǎo)致載體自身環(huán)化機(jī)率增高：減少載體量，最佳比例為2~3﹕1。問題及解決方法

衛(wèi)星菌落

指在正常大小的陽性菌落周圍有一些很小的菌落克隆，這些小的克隆稱為衛(wèi)星菌落。這些衛(wèi)星菌落是Amp敏感的，通常不包含質(zhì)粒。⑴轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪板的密度：用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪板時(shí)，密度較不能太高，每個(gè)90mm平板不超過104菌落。鋪平板時(shí)密度太高也可導(dǎo)致衛(wèi)星菌落的產(chǎn)生。⑵培養(yǎng)時(shí)間：37℃培養(yǎng)的時(shí)間為12-16h，不應(yīng)超過20h。培養(yǎng)時(shí)間過長，氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將β-內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍區(qū)域中的抗生素，從而導(dǎo)致衛(wèi)星菌落的生長。幾種轉(zhuǎn)化方法的比較

CaCl2方法：能達(dá)到5×106~2×108轉(zhuǎn)化子/μg超螺旋質(zhì)粒DNA，可以滿足一般的基因克隆需要。方法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細(xì)菌可以在-70℃保存，但貯存時(shí)間過長將導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的下降。CaCl2/RbCl方法：對某些菌株的轉(zhuǎn)化高于標(biāo)準(zhǔn)的CaCl2轉(zhuǎn)化方法。CaCl2/MnCl2方法：多數(shù)可達(dá)到5×107~1×108。MgCl2方法：聯(lián)合PEG和DMSO，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到107~108，適用菌株廣泛，-70℃保存4個(gè)月后，轉(zhuǎn)化效率無明顯下降。一步操作即可制備感受態(tài)，短暫，轉(zhuǎn)化過程中不需熱休克。DNA用量小(1ng)。高電壓脈沖電擊法：操作簡單，109~1010轉(zhuǎn)化率，對任何菌株均適用。電壓高，脈沖時(shí)間長，則轉(zhuǎn)化率越高，但細(xì)胞死亡率也增高。重組子的篩選與鑒定初篩：1.抗生素平板：只有轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的大腸桿菌才具有抗生素抗性，才能在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長。2.藍(lán)-白篩選：α-互補(bǔ)進(jìn)一步鑒定：1.提取質(zhì)粒后，酶切鑒定------可用于鑒定大小及插入方向。2.SouthernBlot------用標(biāo)記的相應(yīng)外源DNA片段作為探針，與印跡在膜上的DNA雜交，鑒定是否含有靶