酶工程-第七章

第七章

酶的發(fā)酵生產(chǎn)第一節(jié)酶的生產(chǎn)方式第二節(jié)產(chǎn)酶工藝條件及其調(diào)節(jié)控制第三節(jié)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第四節(jié)植物細(xì)胞物發(fā)酵產(chǎn)酶第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶酶的生產(chǎn)是指通過(guò)各種方法獲得人們所需酶的技術(shù)過(guò)程。酶的生產(chǎn)是酶工程的首要任務(wù)，只有通過(guò)生產(chǎn)獲得酶以后，才有可能進(jìn)一步進(jìn)行各項(xiàng)酶學(xué)研究，也才有可能進(jìn)行酶的改性和酶的應(yīng)用等。提取分離法：傳統(tǒng)方法酶的生產(chǎn)生物合成法：20世紀(jì)50年代以來(lái)主要方法化學(xué)合成法：實(shí)驗(yàn)室階段經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作，利用微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞的生命活動(dòng)而獲得人們所需酶的技術(shù)過(guò)程稱為生物合成法。一、生產(chǎn)流程：首先要經(jīng)過(guò)篩選、誘變、細(xì)胞融合、基因重組等方法獲得優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，然后在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的新陳代謝作用，生成所需的酶和各種代謝產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)分離純化得到所需的酶。酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程

二、方法根據(jù)所使用細(xì)胞種類的不同：經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作，利用微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)合成所需酶的生產(chǎn)方法稱為酶的發(fā)酵法生產(chǎn)。根據(jù)微生物細(xì)胞培養(yǎng)方式的不同，可分為液體深層培養(yǎng)發(fā)酵、固體培養(yǎng)發(fā)酵、固定化細(xì)胞發(fā)酵、固定化原生質(zhì)體發(fā)酵等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶生物合成法動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶，也應(yīng)先獲得優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，然后在人工控制條件的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞的生命活動(dòng)合成酶，再經(jīng)分離純化得到所需的酶。三、特點(diǎn)生物合成法與提取分離法比較，具有生產(chǎn)周期較短，酶的產(chǎn)率較高，不受生物資源、地理環(huán)境和氣候條件的影響等顯著特點(diǎn)。生物合成法對(duì)發(fā)酵設(shè)備和工藝條件的要求較高，在生產(chǎn)過(guò)程中必須進(jìn)行嚴(yán)格的控制。第一節(jié)酶的生產(chǎn)方式酶在細(xì)胞內(nèi)合成的過(guò)程稱為酶的生物合成。在酶的生產(chǎn)過(guò)程中，首先要選擇優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，再在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在一定的條件下通過(guò)細(xì)胞的生命活動(dòng)進(jìn)行酶的生物合成，然后經(jīng)過(guò)分離得到所需要的酶。一、細(xì)胞的選擇雖然所有的生物體細(xì)胞在一定條件下都能合成多種多樣的酶，但是在酶的生產(chǎn)中使用的細(xì)胞必須根據(jù)需要進(jìn)行嚴(yán)格的選擇與培育。須具備以下條件：選擇條件⑴酶的產(chǎn)量高⑵容易培養(yǎng)和管理⑶產(chǎn)酶穩(wěn)定性好⑷利于酶的分享純化⑸安全可靠，無(wú)毒性1、微生物產(chǎn)酶的微生物包括細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母等。已廣泛運(yùn)用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)中。常用的產(chǎn)酶微生物：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌、黑曲霉、米曲霉、青霉菌、木霉、根霉、毛霉、紅曲霉、啤酒酵母、假絲酵母等。2、植物細(xì)胞主要用于色素、藥物、香精、酶等次級(jí)代謝物生產(chǎn)。常用的產(chǎn)酶植物細(xì)胞有：見(jiàn)教材。3、動(dòng)物細(xì)胞主要用于疫苗、抗體、激素、多肽、酶等功能蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。動(dòng)物細(xì)胞模式圖植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞種類植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小/um200～3001～1010～100倍增時(shí)間/h﹥120.3-6﹥15營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對(duì)剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較二、培養(yǎng)基的配制在設(shè)計(jì)和配制培養(yǎng)基時(shí)，首先要根據(jù)不同細(xì)胞和不同用途的不同要求，確定各種組分的種類和含量，并調(diào)節(jié)好pH值，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝的需要。不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不同；同一種細(xì)胞用于生產(chǎn)不同物質(zhì)時(shí)，所要求的培養(yǎng)基有所不同；甚至在不同的生理階段，對(duì)培養(yǎng)基的要求也有所不同。必須根據(jù)細(xì)胞的需要配置不同的培養(yǎng)基。1、培養(yǎng)基的基本組分⑴碳源既是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也是能源物質(zhì)。選擇要求：①符合細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求和代謝調(diào)節(jié)的需要。大多數(shù)產(chǎn)酶微生物采用淀粉或其水解產(chǎn)物；植物細(xì)胞通常以蔗糖為碳源；動(dòng)物細(xì)胞則以谷氨酰胺或谷氨酸為碳源。②來(lái)源充分、價(jià)格低廉、有利于發(fā)酵工藝條件并容易使酶分離純化。某些碳源物質(zhì)對(duì)酶生物合成具有代謝調(diào)節(jié)的功能。⑵氮源氮源是細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是酶分子的主要組成元素。氮源可分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。有機(jī)氮源主要是各種蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物；無(wú)機(jī)氮源是各種含氮的無(wú)機(jī)化合物。①選擇要求：動(dòng)物細(xì)胞要求氨基酸、蛋白胨等有機(jī)氮源；植物細(xì)胞主要使用銨鹽、硝酸鹽等無(wú)機(jī)氮源；微生物細(xì)胞中，異養(yǎng)型細(xì)胞要求有機(jī)氮源，自養(yǎng)型細(xì)胞可以采用無(wú)機(jī)氮源，一般微生物采用混合氮源。②注意事項(xiàng)A)使用無(wú)機(jī)氮源時(shí)，銨鹽和硝酸鹽的比例對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和新陳代謝有顯著影響；B)碳氮比（C/N）對(duì)酶的產(chǎn)量有顯著影響。⑶礦物質(zhì)提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需的各種無(wú)機(jī)元素，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)外的pH、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)需要量可分為大量元素和微量元素。大量元素主要指P、S、K、Na、Ca、Mg、Cl等；微量元素主要指Cu、Mn、Zn、Mo、Co、Br、I等。微量元素的需要量應(yīng)嚴(yán)格控制，過(guò)量反而會(huì)影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。礦物質(zhì)通過(guò)在培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)鹽提供。一般采用添加水溶性的硫酸鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽或硝酸鹽。⑷生長(zhǎng)因子指細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖所必須的微量有機(jī)化合物。主要包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素、生長(zhǎng)激素等。嘌呤、嘧啶是某些輔酶或輔基的成分；維生素是輔酶的成分；動(dòng)植物生長(zhǎng)因素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂具有調(diào)節(jié)作用。三、微生物培養(yǎng)基用于微生物培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)的各種培養(yǎng)基的總稱。不同的微生物生產(chǎn)不同的酶，所使用的培養(yǎng)基成分不同。在微生物培養(yǎng)基中，碳源一般采用淀粉或其水解產(chǎn)物，氮源一般采用同時(shí)含有有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源的混合氮源，礦物質(zhì)和生長(zhǎng)因子則根據(jù)微生物生長(zhǎng)的需要進(jìn)行添加。四、植物細(xì)胞培養(yǎng)基用于植物細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)各種產(chǎn)物的培養(yǎng)基。1、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的特點(diǎn)⑴生長(zhǎng)和代謝需要大量礦物質(zhì)。培養(yǎng)液中大量元素的濃度一般為102~3×103mg/L（P41B3-2），微量元素的濃度一般為10-2×30mg/L（P42B3-3）⑵需要多種生長(zhǎng)因子（維生素和生長(zhǎng)激素）。如VB1、VB6、煙酸、肌醇、生長(zhǎng)素、分裂素等。培養(yǎng)液中維生素的濃度一般為0.1~100mg/L（P42B3-6），植物生長(zhǎng)激素的濃度一般為0.1~10mg/L。⑶氮源一般要求為無(wú)機(jī)氮源。⑷碳源一般為蔗糖，濃度為2%~5%。2、常見(jiàn)植物細(xì)胞培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、KM-8P培養(yǎng)基。（見(jiàn)教材）3、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的配置通常將各種組分分成大量元素液、微量元素液、維生素溶液和植物激素溶液等幾大類（10倍或100倍母液，置于冰箱保存）。使用時(shí)，將母液按配方比例混合、稀釋后加入培養(yǎng)基。五、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)各種產(chǎn)物的培養(yǎng)基。1、動(dòng)物細(xì)胞的組分⑴氨基酸：必須加入8種必須氨基酸（賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）以及半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等。⑵維生素：在血清含量低或無(wú)的培養(yǎng)基中須補(bǔ)充B族維生素，有的還須補(bǔ)充Vc。⑶礦物質(zhì)：必須添加含有大量元素的無(wú)機(jī)鹽類，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO33-、SO42-、Cl-、HCO3-等用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。微量元素可由血清提供，在無(wú)血清的培養(yǎng)基中，需要添加Fe、Cu、Zn、Se等。⑷葡萄糖：葡萄糖含量較高的培養(yǎng)基中容易產(chǎn)生乳酸。研究表明，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中，細(xì)胞所需的能量和碳素來(lái)自谷氨酰胺。⑸激素：培養(yǎng)過(guò)程中需要胰島素、生長(zhǎng)激素等。動(dòng)物細(xì)胞所需的激素一般在血清中已存在，在無(wú)血清或低血清的培養(yǎng)基中須添加適量的激素。⑹生長(zhǎng)因子：血清中含有的各種生長(zhǎng)因子能夠滿足動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的需要。在無(wú)血清或低血清的培養(yǎng)基中，需要添加適量的表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。第二節(jié)產(chǎn)酶工藝條件及其調(diào)節(jié)控制在酶的生產(chǎn)過(guò)程中，除了選擇性能優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞和配置適宜的培養(yǎng)基以外，還必須進(jìn)行產(chǎn)酶工藝條件的優(yōu)化控制，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)酶的需要。保藏細(xì)胞細(xì)胞活化細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)分離純化酶固定化細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)產(chǎn)酶無(wú)菌空氣原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體培養(yǎng)基酶生產(chǎn)工藝流程一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)為了保持細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和遺傳特性，可通過(guò)各種保藏方法進(jìn)行細(xì)胞的貯藏。1、細(xì)胞活化在細(xì)胞應(yīng)用過(guò)程中，保藏的細(xì)胞須先接種于新鮮培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞的生命活性得以恢復(fù)，此過(guò)程稱為細(xì)胞活化。2、擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)活化的細(xì)胞在種子培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)一級(jí)乃至數(shù)級(jí)的擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量?jī)?yōu)質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。⑴培養(yǎng)基的成分：種子擴(kuò)大培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基一般應(yīng)含有較為豐富的氮源，碳源可相對(duì)少一點(diǎn)。⑵培養(yǎng)條件：溫度、pH、溶解氧等條件，應(yīng)盡量滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的需要。培養(yǎng)時(shí)間一般以培養(yǎng)到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為宜。接種量一般為培養(yǎng)基總量的1%~10%。二、pH的調(diào)節(jié)控制培養(yǎng)基的pH值與細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖以及產(chǎn)酶關(guān)系密切。除在起始培養(yǎng)基應(yīng)調(diào)節(jié)到適宜的pH，在產(chǎn)酶過(guò)程中必須根據(jù)變化的情況進(jìn)行必要的調(diào)節(jié)控制。1、生長(zhǎng)最適pH：不同的細(xì)胞，其生長(zhǎng)繁殖的最適pH不同。細(xì)菌或放線菌：中性或偏弱堿性，pH=6.5~8霉菌和酵母：偏酸性，pH=4~6植物細(xì)胞：偏酸性，pH=5.2~5.8動(dòng)物細(xì)胞：中性，pH=7.2~7.62、細(xì)胞產(chǎn)酶最適pH：細(xì)胞產(chǎn)酶最適pH通常接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH。如生產(chǎn)堿性、中性、酸性蛋白酶時(shí)的pH。但個(gè)別酶在其催化反應(yīng)的最適條件下，產(chǎn)酶細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝可能受到影響，其細(xì)胞產(chǎn)酶最適pH與酶催化反應(yīng)的最適pH有所差別。如枯草桿菌堿性磷酸酶。有些細(xì)胞可同時(shí)產(chǎn)生若干種酶，通過(guò)控制培養(yǎng)的pH，可以控制各種酶之間的產(chǎn)量比例。3、調(diào)節(jié)控制最適pH的方法隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)基的pH往往會(huì)發(fā)生變化。這與細(xì)胞的特性、培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分或生產(chǎn)工藝條件相關(guān)，在產(chǎn)酶過(guò)程中可根據(jù)需要對(duì)培養(yǎng)基的pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方法有：⑴改變培養(yǎng)基的組分或其比例；⑵使用緩沖液穩(wěn)定pH；⑶加入適量的稀酸、稀堿溶液調(diào)節(jié)pH。三、溫度的調(diào)節(jié)的控制產(chǎn)酶細(xì)胞只有在一定的溫度范圍內(nèi)才能正常生長(zhǎng)、繁殖和維持正常新陳代謝。不同的細(xì)胞有各自不同的最適生長(zhǎng)溫度。但有些細(xì)胞產(chǎn)酶的最適溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)的最適生長(zhǎng)溫度有所不同，一般會(huì)低于生長(zhǎng)最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時(shí)間，從而提高酶的產(chǎn)量。生產(chǎn)中須進(jìn)行最適實(shí)驗(yàn)，以確定最適產(chǎn)酶溫度。細(xì)胞在生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的過(guò)程中，由于新陳代謝作用，會(huì)不斷放出熱量，致使培養(yǎng)基的溫度升高，同時(shí)由于培養(yǎng)基中的熱量的不斷擴(kuò)散，培養(yǎng)基溫度下降。兩者綜合的結(jié)果，決定了培養(yǎng)基的溫度。在細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的不同階段，細(xì)胞釋放的熱量有較大差異；而熱量的散失，受到環(huán)境溫度等因素的影響。因此，應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基的溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，使培養(yǎng)基維持在適宜的溫度范圍內(nèi)。調(diào)節(jié)控制的方法一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。一般生物反應(yīng)器均有各種熱交換裝置。四、溶解氧的調(diào)節(jié)控制指溶解在培養(yǎng)基（液體）中的氧氣。一般情況下培養(yǎng)基的溶解氧較少。但培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞主要吸收和利用溶解氧，在培養(yǎng)過(guò)程中溶解氧將很快被消耗完，致使細(xì)胞培養(yǎng)受阻。在生產(chǎn)過(guò)程中須不斷供給氧（無(wú)菌空氣），使培養(yǎng)基中的的溶解氧保持在一定的水平。1、溶解氧的調(diào)節(jié)控制理論：主要根據(jù)細(xì)胞對(duì)溶解氧的需要量，連續(xù)不斷的進(jìn)行補(bǔ)充，使培養(yǎng)基中的溶解量的保持在一定水平。式中：KO2——耗氧速率，mmol氧/(h.L)QO2——細(xì)胞呼吸強(qiáng)度，mmol氧/(h.g干細(xì)胞)或mmol氧/(h.每個(gè)細(xì)胞)Cc——細(xì)胞濃度，g干細(xì)胞/L細(xì)胞對(duì)溶解氧的需要量與細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度及培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度密切相關(guān)。在酶的生產(chǎn)過(guò)程中，處于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞，其細(xì)胞濃度和細(xì)胞呼吸強(qiáng)度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此，必須根據(jù)耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。2、溶解氧的供給一般將無(wú)菌空氣通入發(fā)酵容器，在一定條件下使空氣中的氧溶解到培養(yǎng)液中，以供細(xì)胞生命活動(dòng)的需要。培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度（溶氧速率或溶氧系數(shù)）。溶氧速率指單位體積的發(fā)酵液在單位時(shí)間內(nèi)所溶解的氧的量，用Kd表示，單位為mmol氧/(h.L)。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時(shí)間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)有密切關(guān)系。一般通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時(shí)間、氣液接觸面積與溶氧速率成正比。另外培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡以及溫度對(duì)溶氧速率也有明顯影響。當(dāng)KO2=Kd，培養(yǎng)液中的溶解氧的量保持恒定，可以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶的需要。3、調(diào)節(jié)溶解氧的主要方法當(dāng)細(xì)胞耗氧速度發(fā)生改變時(shí)，必須相應(yīng)對(duì)溶氧速率進(jìn)行調(diào)節(jié)。⑴調(diào)節(jié)通氣量⑸改變培養(yǎng)液的性質(zhì)⑶調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間⑵調(diào)節(jié)氧的分壓⑷調(diào)節(jié)氣液接觸面積第三節(jié)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶一、微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的方式及其特點(diǎn)酶的發(fā)酵生產(chǎn)根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，分為：固體培養(yǎng)發(fā)酵液體深層發(fā)酵固定化細(xì)胞發(fā)酵固定化原生質(zhì)體發(fā)酵1、固體培養(yǎng)發(fā)酵在固體或者半固體培養(yǎng)基中接種微生物，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，以獲得所需酶的發(fā)酵方法。⑴主要目的：獲得淀粉酶類和蛋白酶類，用于催化淀粉的蛋白質(zhì)的水解。⑵工藝特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、麩曲中酶的濃度較高，特別適應(yīng)于各種霉菌的培養(yǎng)和產(chǎn)酶。但勞動(dòng)強(qiáng)度大，原料利用率低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。⑵液體深層發(fā)酵在液體培養(yǎng)基中接種微生物，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)得到所需酶的發(fā)酵方法。適合于微生物細(xì)胞的發(fā)酵生產(chǎn)，也可用于動(dòng)、植物細(xì)胞的培養(yǎng)。是目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式。工藝特點(diǎn)：機(jī)械化程度較高，技術(shù)管理較嚴(yán)格，酶的產(chǎn)率較高，質(zhì)量較穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率較高。⑶固定化細(xì)胞發(fā)酵是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的發(fā)酵技術(shù)。固定化細(xì)胞是指在固定在水不溶性的載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。工藝特點(diǎn)：細(xì)胞密度大，產(chǎn)酶能力高；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可反復(fù)或連續(xù)使用；細(xì)胞固定在載體上，流失較少，可以在高稀釋率的條件下連續(xù)發(fā)酵，利于自動(dòng)化生產(chǎn)，并有利于酶的分離純化。⑷固定化原生質(zhì)體發(fā)酵指在固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的原生質(zhì)體。固定化原生質(zhì)沒(méi)有細(xì)胞壁的屏障，有利于胞內(nèi)物質(zhì)透過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散到胞外，從而可不經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎和提取工藝直接從發(fā)酵液中分離得到所需的酶。固定化原生質(zhì)體發(fā)酵為胞內(nèi)酶等胞內(nèi)物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)辟了新途徑。二、提高酶產(chǎn)量的措施酶的生產(chǎn)過(guò)程中，在選擇使用優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化控制之外，所采取的措施。添加誘導(dǎo)物控制阻礙物的濃度添加表面活性劑添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑1、添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物是能夠使某些酶的生物合成開(kāi)始或者加速進(jìn)行的物質(zhì)。在誘導(dǎo)酶的發(fā)酵過(guò)程中，添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物，在一定的條件下，就可以加速酶的生物合成，提高酶的產(chǎn)量。一般來(lái)說(shuō)，不同的酶有不同的誘導(dǎo)物；同一種酶往往有多種誘導(dǎo)物。誘導(dǎo)物一般分三類：酶的作用底物、酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物和作用底物的類似物。2、控制阻礙物的濃度指能夠引起某些酶的生物合成停止或減速進(jìn)行的物質(zhì)。阻遏作用根據(jù)作用機(jī)理的不同分為以下二種：產(chǎn)物阻遏除去終產(chǎn)物添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑分解代謝物阻遏避免使用葡萄糖避免培養(yǎng)基過(guò)于豐富添加一定量的cAMP3、添加表面活性劑細(xì)胞膜具有選擇透性，用于控制胞外物質(zhì)的吸收和胞內(nèi)物質(zhì)的分泌。在培養(yǎng)基中添加表面活性劑，能夠與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過(guò)性，有利于胞外酶的分泌，提高酶的產(chǎn)量。表面活性劑離子型對(duì)細(xì)胞有毒害作用非離子型Tween－80TritonX－100增加細(xì)胞通透性4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑指可以促進(jìn)產(chǎn)酶，但是作用機(jī)理尚未闡明清楚的物質(zhì)。但其能夠提高酶的產(chǎn)量。三、酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)速度、產(chǎn)物生成速度、基質(zhì)消耗速度以及環(huán)境因素對(duì)速度的影響的學(xué)科。在酶的生產(chǎn)過(guò)程中，研究細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)，對(duì)于了解本科的生物合成模式、發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化控制、提高酶的產(chǎn)率等方面均具有重要意義。(一)酶生物合成的模式在分批培養(yǎng)(batchculture)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)一般要經(jīng)歷調(diào)整期（延遲期）、指數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)期和衰亡期四個(gè)階段。時(shí)間/h細(xì)胞濃度/(mg/mL)OACDB

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

O-A調(diào)整期A-B指數(shù)生長(zhǎng)期B-C平穩(wěn)期C-D衰亡期總細(xì)胞濃度活細(xì)胞濃度(一)酶生物合成的模式在分批培養(yǎng)(batchculture)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)一般要經(jīng)歷調(diào)整期、指數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)期和衰亡期四個(gè)階段。時(shí)間/h細(xì)胞濃度/(mg/mL)OACDB

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

O-A調(diào)整期A-B指數(shù)生長(zhǎng)期B-C平穩(wěn)期C-D衰亡期總細(xì)胞濃度活細(xì)胞濃度根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為四種模式，即：

同步合成型生長(zhǎng)偶聯(lián)型——中期合成型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型——延續(xù)合成型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型——滯后合成型1、生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱同步合成型）酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的生物合成立即停止，表明這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。時(shí)間/h細(xì)胞濃度/(mg/mL)

枯草桿菌堿性磷酸酶生物合成曲線細(xì)胞濃度酶濃度

0268410酶濃度/(U/mL)2、生長(zhǎng)偶聯(lián)型中的特殊形式——中期合成型酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開(kāi)始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。3、部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）酶的合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線4、非生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶才開(kāi)始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素1、mRNA的穩(wěn)定性高：可在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼續(xù)合成酶；差：隨著細(xì)胞停止生長(zhǎng)而終止酶的合成。2、培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開(kāi)始酶的合成。受阻遏：細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或平衡期后，酶才開(kāi)始合成。酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開(kāi)始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。

(二)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）和生長(zhǎng)速率之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系：Monod模型μ:比生長(zhǎng)速率（1/h）（specificgrowthrate）μmax：最大比生長(zhǎng)速率（1/h）S：營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）克/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營(yíng)養(yǎng)物利用常數(shù)

克/L，或mol/L(三)產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)一般產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表達(dá)為：式中：X——細(xì)胞濃度(g/L)

——細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(h-1)

——生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g)

——非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh))

E——酶濃度(IU/L)

t——時(shí)間(h)生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型

非生長(zhǎng)偶聯(lián)型

四、固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶固定化細(xì)胞是指采用各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。(一)固定化細(xì)胞產(chǎn)酶的特點(diǎn)1、提高產(chǎn)酶率2、可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間3、穩(wěn)定性好4、縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率5、產(chǎn)品容易分離純化6、適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)(二)固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件控制與游離細(xì)胞發(fā)酵工藝條件基本相同。但其工藝條件控制需要注意以下事項(xiàng)：1、固定化細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)2、溶解氧的供給3、溫度的控制4、培養(yǎng)基組分的控制(三)固定化細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)參照前節(jié)1、固定化細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)2、固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)3、固定化細(xì)胞連續(xù)產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)五、固定化原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶固定化原生質(zhì)體是指采用各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍進(jìn)行生命活動(dòng)的原生質(zhì)體。固定化原生質(zhì)體有利于氧氣和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和酶的分泌，可以顯著提高酶產(chǎn)率。固定化原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶具有操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性。工藝條件控制需要注意：1、滲透壓的控制；2、防止細(xì)胞壁再生；3、保證原生質(zhì)體的濃度。第四節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)是從植物外植體中獲得植物細(xì)胞，然后在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得各種所需產(chǎn)物的技術(shù)過(guò)程。植物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)產(chǎn)酶是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，通過(guò)誘導(dǎo)從外植體獲得植物細(xì)胞，再經(jīng)篩選、誘變、原生質(zhì)體融合或基因重組選育優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酶細(xì)胞，在人工控制條件的反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)酶。植物細(xì)胞產(chǎn)酶同樣具有提高產(chǎn)率、縮短周期、提高產(chǎn)量等顯著優(yōu)點(diǎn)，且不受地理環(huán)境和氣候條件的影響，具有深遠(yuǎn)的意義和廣闊的應(yīng)用前景。一、植物細(xì)胞的特性1、植物細(xì)胞較大（直徑和體積）2、生長(zhǎng)速率和代謝速率較低，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)3、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單4、培養(yǎng)需要一定的光照強(qiáng)度和時(shí)間5、對(duì)剪切力敏感6、生產(chǎn)的產(chǎn)物不同于其它細(xì)胞培養(yǎng)二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)1、產(chǎn)率高2、周期短3、易于管理，勞動(dòng)強(qiáng)度低4、產(chǎn)品質(zhì)量高三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制1、溫度的控制室溫下（25℃）培養(yǎng)，范圍應(yīng)控制在20~32℃。溫度高有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，溫度低有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。2、pH的控制最適pH=5~6，在配制培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將培養(yǎng)基控制在pH=5.5~5.8。植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，pH變化較小。3、溶解氧的調(diào)節(jié)控制植物細(xì)胞代謝較慢，需氧量較小，過(guò)量的氧具有不良影響。另外植物細(xì)胞體積較大，對(duì)剪切力敏感，強(qiáng)烈的通風(fēng)和攪拌會(huì)破壞植物細(xì)胞。4、光照的控制光照對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)有重要影響。大多數(shù)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)要求一定波長(zhǎng)的光的照射，并對(duì)光照強(qiáng)度和時(shí)間有一定的要求。有些次級(jí)代謝物的生物合成會(huì)受到光的抑制。5、前體的添加前體是指目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì)。在培養(yǎng)過(guò)程中添加前體物質(zhì)可以有效的提高次級(jí)代謝物的產(chǎn)量。6、刺激劑的應(yīng)用刺激劑可以促使植物細(xì)胞中的物質(zhì)代謝朝著某些次級(jí)代謝產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行，提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的提高。常用的刺激劑有微生物細(xì)胞壁碎片和果膠酶、纖維素等微生物胞外酶。四、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的過(guò)程以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)為例：SOD具抗輻射、抗氧化、抗衰老等功效。1、大蒜愈傷組織的培養(yǎng)2、大蒜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)3、