第八章微生物監(jiān)測環(huán)境

第八章微生物監(jiān)測環(huán)境第一節(jié)環(huán)境污染的指示微生物第二節(jié)污染物生物毒性的微生物學檢測方法第三節(jié)污染物致突變性的微生物檢測方法一、一般污染指示微生物指示微生物：在常規(guī)環(huán)境監(jiān)測中，用以指示環(huán)境樣品污染性質與程度，并評價環(huán)境衛(wèi)生狀況的具有代表性的微生物。（一）細菌總數1、定義：環(huán)境中被測樣品在一定條件下培養(yǎng)后所得的1mL或1g檢樣中所含有的細菌菌落總數。反映環(huán)境中異養(yǎng)型細菌的污染從度，也間接反映一般營養(yǎng)性有機物的污染程度。2、方法（1）液態(tài)與固態(tài)對象中的細菌總數：

將經過一定倍數稀釋的樣品懸液，定量接種（傾注或圖布）于營養(yǎng)平板，有氧37℃培養(yǎng)48h后觀察菌落。（2）空氣中的細菌總數：平板暴露沉降法采用直徑9cm平皿在1.2m高處暴露5min，培養(yǎng)計數；奧氏公式：5min內落在100cm2營養(yǎng)瓊脂平板上的細菌數和10L空氣中所含的細菌數相同最小采樣量和最小沉降面積（為避免出現“0”粒的概率，確保結果可靠性）。儀器法采用固體撞擊式采樣器。C=1000×50NA×tC－空氣細菌數A－捕集面積，cm2t－暴露時間，minN－菌落數，個菌落計算方法有效菌落：無片狀菌落的平皿；若片狀菌落不到培養(yǎng)皿一半，而另一半分布又均勻，可以半皿計數再乘2代表全皿；選擇平均菌落數在30～300之間進行計算；若有兩個稀釋度的平均符合，按兩者菌落總數之比來決定，<2報告平均數，>2則報告較少的菌落總數；若均大于300（小于30），按稀釋度最高（低）的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；若所有稀釋度均不在30～300之間，則以最接近的報告。報告方式：<100報告實有數字；>100采用兩位有效數字，余者四舍五入；無法計算時，注明稀釋倍數結果：cfu/ml或cfu/g細菌總數的衛(wèi)生標準生活飲用水<100cfu/ml室內空氣<500～1000/m3室內空氣指示菌以咽喉正常菌叢中的綠色鏈球菌為最合適，在上呼吸道和空氣中較易發(fā)現。對方法的評價：相對性無菌水1.

稀釋平板計數法—固體培養(yǎng)法第一步：菌樣巧妙稀釋得到不同稀釋度（10-x）菌液菌樣被無菌水不同稀釋倍率后平板培養(yǎng)圖

10-2

10-3

10-4

10-5

各取1ml，均勻涂布于冷固體培養(yǎng)基平板上或與溫熱液態(tài)固體培養(yǎng)基混合冷卻。第三步：培養(yǎng)稀釋度過低，菌落密集無法計數可以計數，但數量過多，費時費力數量合適，統(tǒng)計計算，作為結果數量太少，誤差因素太大，不做計數第二步：接種平板每一個細菌會生成一個菌落一般計數平板的細菌生長菌落數以30~300個為宜。第四步：計數細菌數量=？細菌數量=數出的菌落數/稀釋度例如：10-5稀釋度時菌落數為125個細菌數量=125/10-5=1.25×107個/mL

平板計數法是采用最廣的一種活菌計數法如國標法水中細菌總數的測定。注意：作空白及取平行樣（2～3組）均值減小誤差平均（二）霉菌和酵母菌總數意義：偏酸性好氧條件，存活力強，有機營養(yǎng)物廣泛；反映環(huán)境的一般性污染。方法：虎紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基等；傾注平板法；25-28℃3-5天。結果：cfu/ml或cfu/g衛(wèi)生標準：方法評價：主要適用于霉菌，酵母菌附帶生長，均非環(huán)境中全部酵母菌。二、糞便污染指示菌（一）糞便污染指示菌的理想條件：是人畜糞便中的正常菌，且數量較糞便中其他菌為多受人畜糞便污染的環(huán)境中可檢出，而未受污染環(huán)境無該菌存在排出至環(huán)境后，該菌存活時間與腸道致病菌相當或略長對氯等消毒劑及其他不良因素的抵抗力略強于腸道致病菌檢出與鑒定方法比較簡便迅速（二）總大腸菌群是一群能在37℃，24h內發(fā)酵乳糖產酸產氣，需氧或兼性厭氧的G-無芽孢桿菌；主要包括四個菌屬：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬；方法：多管發(fā)酵法、濾膜法。不適于用大腸菌群作為糞便污染指示菌的食品冷凍食品經射線照射處理的食品

pH較高的食品在上述食品中大腸菌群的細菌比許多腸道病原微生物更易死亡1、多管發(fā)酵法初發(fā)酵：在2個各裝有已滅菌的50mL濃乳糖蛋白胨的大發(fā)酵瓶中，無菌操作加入水樣100mL；在10只含5mL培養(yǎng)基的發(fā)酵管中加水樣10mL，混勻后37℃培養(yǎng)24h；如無酸及氣體產生，為“－”；如有酸和氣體，或無氣體但有酸產生，為“＋”；如有氣體產生，但沒產酸，溶液也不渾濁，可能是操作技術問題，須重作檢驗；平板分離：從陽性管中取液，分別接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍培養(yǎng)基上，注意編號，

37℃培養(yǎng)24h。多管發(fā)酵法如無細菌增殖現象，為“－”；如僅發(fā)現芒狀、霉狀或其他無關菌屬的菌落，為“－”；挑取符合下列特征的菌落1/3涂片、G染色、鏡檢；品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基：紫紅色，具金屬光澤；深紅色，不帶或略帶金屬光澤；淡紅中心色較深；伊紅美藍培養(yǎng)基：深紫黑色，具金屬光澤；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色，中心色較深。多管發(fā)酵法復發(fā)酵試驗：挑取鏡檢G-無芽孢桿菌的其余部分菌落，接種于含10mL普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24h，觀察產酸產氣；根據復發(fā)酵結果，統(tǒng)計出陽性管及瓶數，查表得出總大腸菌群數。多管發(fā)酵法水源水檢驗時水樣稀釋10倍，預備15支發(fā)酵管，5支裝5ml濃培養(yǎng)基，加水樣10ml；10支裝10ml普通培養(yǎng)基，5支加水樣1ml，5支加稀釋水樣1ml；以后檢測同飲用水，根據存在的陽性管數查另外的檢數表。濾膜法比發(fā)酵法縮短時間，有可能在24h內完成?？讖?.45-0.65μm，多孔性硝化纖維膜；濾膜滅菌：蒸餾水煮15min×3次；濾器滅菌：酒精棉球火焰滅菌或121℃30min；過濾水樣：粗糙面向上，過濾水量的確定以培養(yǎng)后濾膜上長出的菌落不多于50個為原則。濾膜法水樣過濾后，繼續(xù)抽氣5s關閉，帶菌濾膜置于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，二者之間不得留有氣泡，37℃培養(yǎng)24h；挑取特征菌落染色鏡檢；G-無芽孢桿菌的穿刺接種到乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基（預先煮沸排氣），37℃培養(yǎng)6～8h，產氣者為“＋”，培養(yǎng)基內部形成龜裂狀，甚至部分上??；結果與衛(wèi)生標準：大腸菌群數（個/L或個/ml）；飲用水標準：0個/100ml，土壤<100個/g大腸菌群值：水樣中可檢出1個大腸菌群細菌的最小水樣容積；土壤>10-2方法評價：發(fā)酵法耗時長、濾膜法不適于混濁度高的水樣、結果可能不準確、不能指示水中細菌；來源不單一；不能指示病毒新進展：“大腸菌群產色基質試驗”兩個活性底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷及4－甲基傘形酮基-β-D葡萄糖醛酸，分別被大腸菌群的β－半乳糖苷酶和大腸桿菌的β－葡萄糖醛酸酶分解產生黃色的鄰硝基苯和發(fā)熒光的化合物，24h即可完成糞大腸菌群能在44.5℃發(fā)酵乳糖的大腸菌群，亦稱耐熱性大腸菌群。糞大腸菌群與糞便中大腸桿菌數直接相關，且在外環(huán)境中不易繁殖，因此意義更大。方法：多管發(fā)酵法、濾膜法EC培養(yǎng)基：三號膽鹽、胰蛋白胨、乳糖M-TEC培養(yǎng)基：眎蛋白胨、酵母膏、乳糖、十二烷基磺酸鈉、脫氧膽鹽鈉、溴甲酚紫、溴酚紅等糞大腸菌群結果：同總大腸菌群衛(wèi)生標準：方法評價：是種較好的水中腸道致病菌的指示菌糞鏈球菌意義：在人糞便中數量僅次于大腸菌群細菌在水中不會自行繁殖，但抵抗力弱于致病菌為水質細菌學評價提供有意義的補充材料根據Fe/Fs（糞大腸菌群/糞鏈球菌）∮來推測糞便污染的來源，僅適于新鮮污染方法：多管發(fā)酵法、濾膜法Fe/Fs≥4，認為污染主要來自于人糞；≤0.7，主要來自溫血動物糞便<4而>2，混合污染以人糞為主<1而>0.7，混合污染以動物糞便為主產氣莢膜梭菌∮意義：存在于人及溫血動物糞便中，具有芽孢的厭氧桿菌；具有較強抵抗力，特別適用于含有毒物質的水體方法：多管發(fā)酵法、濾膜法、傾注法蛭弧菌∮意義：天然寄生菌，對污染的指示滯后，其指示污染可彌補大腸菌群的不足。方法：自來水雙層瓊脂平板法產氣莢膜梭菌蛭弧菌第三節(jié)其他指示微生物致病菌的指示菌沙門氏菌志賀氏菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌鏈球菌破傷風梭菌腸炎沙門氏菌志賀氏菌銅綠假單胞菌產色素的銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌鏈球菌破傷風梭菌腸道病毒的指示微生物脊髓灰質炎病毒選用理由：脊髓灰質炎病毒疫苗株對環(huán)境壓力相對穩(wěn)定，抵抗力較其它病毒強，操作相對安全，與其他病毒比較易從環(huán)境樣品中檢測到濃縮方法：濾膜法、氫氧化鋁吸附沉淀法、聚乙二醇脫水透析法檢測方法：蝕斑實驗、免疫學法噬菌體f2選用理由：與腸道病毒基本性狀相似，核酸均為RNA，理化性質相近；存在于人類糞便中，在水和污水中存在的數目多于腸道病毒；對外環(huán)境和氯的耐受力與腸道病毒相似或稍強；檢測方法簡單檢測方法：空斑定量測定法不足之處：在人糞便中數量不多；DNA大腸桿菌噬菌體在人類糞便中經常存在，并可能在水環(huán)境中繁殖，易掩蓋或混淆。作為腸道病毒污染指標不理想，可作為消毒效果評價指標第二節(jié)

污染物生物毒性的微生物學檢測方法

一、原核微生物檢測法發(fā)光細菌——細菌生物發(fā)光抑制試驗細菌發(fā)光的生物學機制：NADH2FMN細胞色素O2蟲熒光色素酶O2，醛激活的蟲熒光色素酶蟲熒光色素酶+光（一）細菌生物發(fā)光抑制試驗試驗原理環(huán)境條件不良或有毒物存在時，因細菌熒光素酶活性或細胞呼吸受到抑制，發(fā)光能力受影響而減弱，其減弱程度與毒物的毒性大小和濃度成一定比例關系常用明亮發(fā)光桿菌“Microtox”法，是目前國際通用、使用最為廣泛的污染物毒性微生物學檢測方法細菌生物發(fā)光抑制試驗試驗方法菌種復蘇：加入2％NaCl，穩(wěn)定1～2h樣品處理：樣品稀釋并調pH6~8，同時調溶液的滲透壓使之含2％NaCl。毒性測定：定量加入菌液和樣品，15℃培養(yǎng)5或10min，直接讀出光量抑制百分率求不同劑量及其IR之間的回歸方程，計算IC50凍干菌種：白色粉末狀，含4％發(fā)光菌細胞，2％NaCl，保護劑和緩沖物質，－20～－25℃?zhèn)溆茫行谝荒闕R＝陰性對準組指標值－實驗組指標值陰性對準組指標值×100％陽性有機對照－苯酚陽性無機對照－Zn2+陰性對照－蒸餾水細菌生物發(fā)光抑制試驗質量控制同一劑量平行測定管間的發(fā)光強度差異值應<20％100mg/L苯酚的IC50,5min應為13～26mg/L100mg/LZnSO4?7H2O的IC50,15min應為3～10mg/L 細菌生物發(fā)光抑制試驗方法評價與傳統(tǒng)魚類96h毒性試驗有良好的一致性靈敏、快速，自動化程度高各實驗室間重現性好，變異系數10～20％，明顯好于傳統(tǒng)魚類96h毒性試驗目前“Microtox”已有效地應用于化學物質的定量構效關系研究（二）硝化細菌——硝化作用抑制試驗試驗原理毒物抑制硝化作用的酶類導致亞硝化或硝化細菌對底物的利用能力或產物生產量下降。通過測量底物或產物的變化來檢測污染物毒性作用的程度試驗方法：方法評價：靈敏度與“Microtox”相當，但結果相關性較差菌種增至108個/ml定量加入菌液、NaNO2溶液、不同濃度樣品，蒸餾水做對照30℃培養(yǎng)4h，定時取樣分析NO2-含量隨時間變化，得出硝化作用強度比較樣品組與對照組，可得IC50二、真核微生物檢測法（一）藻類——生長抑制試驗試驗原理：常用硅藻、柵藻、小球藻等，生長迅速，對水質變化敏感，通過測定其生長量來反應水質污染情況或物質毒性程度試驗方法：藻體生長量；釋出氧量；攝取14C量；細胞DNA及ATP測定結果評價與標準：藻細胞最大生長速率與對照相比降至50％以下，且呈劑量反應關系時，即可認為受試物有毒性作用（二）原生動物——微尺度群落級毒性試驗試驗原理：在正常條件下自然界水環(huán)境的微型生物群落種類、分布與構成均有一定規(guī)律。在外界環(huán)境因素的干擾下，群落的平衡被破壞，結構特征也隨之變化。通過分析相關的微型生物群落結構參數，即可判斷水環(huán)境的質量狀況或污染物質的毒性特征。具有很強的生態(tài)學意義。原生動物——微尺度群落級毒性試驗聚氨酯泡沫塑料塊（PFU）法作為微型動物的生態(tài)島，其上原生動物群集速度隨種類上升而下降，兩者交叉點及為平衡點，達到平衡時間取決于環(huán)境條件據報道：孔徑100～150μm，厚度5cm，規(guī)格5×6.5×7.5cm3為好，可依靠垂墜物懸掛在任何水層據報道：其擠出液可見到水體中大約85％的原生動物種類，可以反映整個群落動態(tài)變化的全過程和基本趨勢原生動物——微尺度群落級毒性試驗試驗方法與評價：一般情況下，隨著污染程度的升高，原生動物種類數（S）會減少，多樣性指數（d）會降低，Seq會下降；在一個以異養(yǎng)型生物為主的水體中，異養(yǎng)型指數（HI）高，表示存在有機污染，此時群集速度常數（G）會增大，T90會縮短三、活性污泥毒性檢測法脫氫酶活性試驗試驗原理：活性污泥中微生物的脫氫酶類能使被氧化有機質的氫原子活化并傳遞給特定的氫受體，反映活性污泥對污水中有機質的氧化分解能力。毒性物質的存在會抑制脫氫酶的活性，可通過指示劑的還原變色速度來確定脫氫酶的活性，以判斷毒性物質的作用強度。常用指示劑為TTC（氯化三苯基四氮唑），它受氫后變?yōu)榧t色TF（三苯基甲臜）（485nm）脫氫酶活性試驗試驗方法：TF標準曲線的制作馴化的活性污泥經離心洗滌制成懸浮液在測定管中定量加入懸浮液、Tris-HCl緩沖液、樣品、TTC等，以蒸餾水做對照37℃水浴避光反應顯色，加濃硫酸終止加入丙酮萃取TF，離心上清液485nm比色，得TF產生量，計算脫氫酶活性酶活：指酶催化化學反應的能力，衡量標準是酶促反應速度的大小，用單位時間內底物的消耗量或產生生成量來表示呼吸抑制試驗試驗原理：廢水中有毒物質可以抑制微生物的呼吸，使其耗氧量和CO2產生量下降，下降的程度與毒性物質的濃度和強度有關試驗方法：傳統(tǒng)的瓦勃氏呼吸儀法和目前的直接測定DO法結果評價：相對好氧速率＝污泥的呼吸耗氧速率內源性呼吸耗氧速率×100％四、微生物學檢測法評價簡便靈敏快速經濟結果的差異性結果的變異性與哺乳動物試驗互為補充第三節(jié)

污染物致突變性的微生物檢測方法一、基因突變試驗二、DNA損傷修復試驗三、DNA重組試驗四、微生物致突變試驗與致癌物的確定一、基因突變試驗鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）應用與評價：良好的環(huán)境致突變物與潛在致癌物初篩報警Ames試驗已被我國食品安全性毒理學評價程序、農藥登記毒理學試驗方法、新藥（西藥）毒理學研究指導原則、化妝品安全性評價程序和方法、食品功能毒理學評價程序和檢驗方法等列為評價致突變性的必做試驗鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）原理：人工誘變的鼠傷寒沙門氏菌株，又稱TA（his）菌株，是組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，在致突變物的作用下，能發(fā)生回復突變?yōu)橐吧透鶕摼谔厥馀囵B(yǎng)基上的生長能力，判斷受試物是否具有致突變性哺乳動物肝勻漿中含微粒體混合功能氧化酶，對間接致突變物有生物活化作用鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）常用菌株：TA97、TA98、TA100、TA102①組氨酸依賴性，+表示需要②深粗糙型脂多糖屏障丟失，+表示缺失，有抑菌③紫外線損傷修復基因缺陷，+表示缺失，無修復能力④抗氨芐青霉素因子，+表示有⑤抗四環(huán)素質粒，+表示有鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）實驗設計：菌株選擇：TA97、TA98、TA100、TA102溶劑選擇：根據受試物的理化性質，水溶性的最好用滅菌雙蒸水，非水溶的一般常用二甲基亞砜（DMSO），每皿有機溶劑用量不得超過0.1ml鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）劑量選擇：在0.2~500μg/皿之間選擇2或3個劑量，常用為0.2、2、20、500μg/皿。有殺菌作用的包括一個最低殺菌濃度，有沉淀的包括一個最小沉淀濃度，誘變陰性的包括一個最大溶解濃度，無殺菌作用的最高檢測濃度至少應為500μg/皿。受試溶液應新鮮配制陽性對照物的選擇：必須同時做陽性對照，用以檢定菌株的回變性和特異性以及S-9混合液的效果鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）試驗設計的嚴密性：受試物最少應設三個劑量，以便觀察劑量反應關系，同時設陽性對照、陰性對照和溶劑對照。陰性對照可反應菌株的自發(fā)回變情況，溶劑對照可排除溶劑引起突變的可能性。同一樣品必須做加S-9混合液和不加S-9混合液的試驗。試驗時，每份樣品（包括對照）均應做三個平行樣，至少應做2次重復試驗，方可正式報告結果鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）培養(yǎng)基：S-9液取材：選用200g左右、健康雄性Sprague-Dawley系大鼠或150g左右、健康雄性Wister大鼠。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（增菌用）：含牛肉膏、蛋白胨Vogel-Bonner氏液：含多種無機鹽底層瓊脂（供細菌生長）：含V-B液、葡萄糖頂層瓊脂（致突變試驗）：含生物素、組氨酸鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）營養(yǎng)瓊脂（鑒定菌株特性）氨芐青霉素平皿（鑒定R因子）：含V-B液、葡萄糖、生物素、組氨酸、氨芐青霉素組氨酸/生物素平皿（鑒定His）：含V-B液、葡萄糖、生物素、組氨酸Master平板（短期保存菌種）：含V-B液、葡萄糖、生物素、組氨酸、氨芐青霉素鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）試驗方法：紙片點試法：定性試驗結果評價：如果僅在平板上出現少量的散的菌落認為是陰性致突變物。如果浸有受試物的紙片周圍長出較多密集的回變菌落與空白對照有明顯區(qū)別者，可判定該受試物為陽性致突變物紙片周圍回變菌落數<20，為“-”紙片周圍回變菌落數<100，為“+”紙片周圍回變菌落數<200，為“++”紙片周圍回變菌落數<500，為“+++”紙片周圍回變菌落數>500，為“++++”鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）平皿滲入法：定量試驗結果評價：陽性結果的判斷：滲入試驗必須同時獲得下列結果，才能確定測試物為陽性致突變物背景菌落生長良好測試皿回變菌落數比對照皿回變菌落數增加2倍以上有劑量反應關系試驗結果有重現性鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）陰性結果的判斷：滲入試驗必須同時獲得下列結果，才能確定測試物為陰性致突變物對于純化學受試物，當試驗濃度達500μg/皿（或對測試菌株最大無抑制用劑量）仍未見陽性結果者，±S-9試驗結果陰性不同菌株試驗結果均為陰性重復檢驗也均為陰性鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）注意事項無菌操作。本試驗全部操作必須嚴格無菌，所使用的溶液、培養(yǎng)基、器材等必須經過滅菌，以防其它細菌或霉菌污染測試菌株的菌液必須是新培養(yǎng)的新鮮菌液，每ml活菌數不得少于2×108個。菌株在使用前應進行鑒定試驗中所用的陽性對照物對人體有害，操作時，應加強個人防護應有良好的、具通風換氣設備的實驗室鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）注意事項一切帶有測試菌的器皿，用后立即高壓滅菌，若來不及滅菌則放在加蓋容器內，嚴防任何小動物特別是老鼠接觸所用有機溶液必須重新蒸餾。低溫蒸餾必須用水浴及專用蒸餾器，并在通風柜內進行，嚴防明火接觸，以免發(fā)生火災使用的蒸餾水必須是重蒸水。配試劑及培養(yǎng)基要用新蒸的蒸餾水，保證一切溶劑無致突變物污染。所有器皿最后也應用新蒸出的蒸餾水洗凈發(fā)光細菌試驗原理：發(fā)光細菌的自發(fā)暗變異株與致突變物接觸后，可恢復一定強度的發(fā)光能力。應用與評價：與Ames試驗檢測遺傳毒性物質所反應的遺傳毒性水平具有較好的一致性；美國Microbics公司標準化方法“Mutatox”發(fā)光細菌試驗方法：步驟：菌株復蘇→增菌→分裝→20℃振蕩24h→開始測定發(fā)光強度（每隔3~4h）結果判定：待測樣品管發(fā)光強度是對照管3倍為陽性結果；樣品管5個平行系列中陽性結果≥3，待測物具致突變性；不足3個為可疑；無陽性結果可認為不具有致突變性其他基因突變試驗營養(yǎng)缺陷型菌株回復突變試驗：類似于Ames試驗細菌的正向突變試驗：正向突變比回復突變的DNA有更多位點可以發(fā)生突變，可以檢測更為廣泛的化合物粗糙脈孢菌的正向突變試驗：真核真菌，用于檢測基因的正向和回復突變構巢曲霉的突變試驗：第二節(jié)DNA損傷修復試驗SOS顯色試驗SOS修復：“易錯性DNA修復”，靠這種修復形成的DNA聚合酶由于識別堿基的精確性低，易造成復制的差錯，進而引起突變原理：致突變因素作用于DNA產生的某些損傷可誘導細菌SOS修復系統(tǒng)的反應，通過檢測SOS修復的能力來查明理化因素是否具有致突變、致癌的特性；可用特定菌株分解特定物質產生色素來反應其中酶的合成水平∮β-半乳糖苷酶分解Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和β－ONPG（鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷），分別產生藍色不溶性色素和黃色可溶性色素SOS顯色試驗方法：檢測細菌細胞原發(fā)直接的SOS反應，即用產色底物來監(jiān)測大腸桿菌SOS修復反應；紙片法定性，液體法定量應用與評價：與Ames的敏感性、準確性相當，且操作簡單、快速、經濟、方便、不受測試菌株存活數的影響；可將二者互為補充共同作為研究遺傳毒物的初篩試驗聚合酶缺陷型菌株試驗原理：多數致癌物質可與DNA結合使之發(fā)生一定的改變和損傷，而微生物具有修復DNA的功能；將同一受試物作用于具有修復能力的野生型菌株和缺乏修復能力的變異株，則微生物的生長可能出現差異；聚合酶缺陷型菌株DNA受損后即不能修復，細菌無法生存聚合酶缺陷型菌株試驗菌株：E.coli

P3478（polA-）和E.coli

W3110（polA+）方法：點試法比較抑菌圈或劃線接種帶應用與評價：只對具有直接致突變作用的烷化物較為敏感對需要代謝活化的化合物如芳香胺、多環(huán)烴等不敏感，加肝勻漿活化系統(tǒng)亦效果不佳在液體培養(yǎng)基中測定對某些原致癌物檢出率有所提高重組缺陷型菌株試驗原理：利用檢驗重組修復能力來判斷致突變性菌株：枯草芽孢桿菌重組缺陷型菌株－Bac.subtilis

M45（recA-）和對照菌株Bac.subtilis

H17（recA+）方法：點試法比較抑菌圈或劃線接種帶應用與評價：在無代謝活化條件下比Ames敏感在有代謝活化條件下檢出率比Ames低溶源性細菌試驗原理：溶源性細菌細胞受到某些誘變劑作用時，產生SOS修復，使菌體內原噬菌體活躍起來，在菌體內大量繁殖，使細菌發(fā)生裂解而釋放；在固體培養(yǎng)基上裂解非溶源性細菌形成噬菌斑菌株：溶源性E.coli

K12（λ）和非溶源性E.coli

K12（S）方法：將兩種菌液按一定比例同時接種于一個平板，放入受試物過夜培養(yǎng)觀察應用與評價：可用于測定復雜混合物的潛在遺傳毒性第三節(jié)DNA重組試驗釀酒酵母的有絲分裂基因轉變可測定致突變物質所致的缺陷型等位基因的轉變異點等位基因二倍體的酵母菌株在其同一基因座位有兩個不同的缺陷型等位基因，其存在導致一定的營養(yǎng)要求在致突變物損傷DNA，導致整個基因組的有絲分裂重組增強，基因轉變隨之發(fā)生，一個突變型整段轉移取代另一突變型等位基因中有缺陷的核苷酸順序，將其中一個基因恢復成野生型等位基因第四節(jié)微生物致突變試驗與致癌物的確定ICPEMC于1983年提出致突變試驗的遺傳學終點分為5類DNA完整性的改變DNA重排或交換DNA堿基序列改變染色體完整性改變染色體分離改變目前沒有一種致突變試驗能涵蓋所有的遺傳學終點。ICPEMC認為需選用一組試驗配套進行檢測，包括5種遺傳學終點。如選用Ames試驗、微核試驗、枯草桿菌DNA修復試驗和外周血淋巴細胞姊妹染色單體互換（SCE）試驗4個項目即可滿足要求第十九章微生物監(jiān)測技術的新發(fā)展第一節(jié)分子生物學技術在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應用第二節(jié)微生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測中的應用第一節(jié)分子生物學技術在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應用分子生物學技術與環(huán)境微生物的分類、鑒定、監(jiān)測傳統(tǒng)方法難以及時動態(tài)監(jiān)測，實驗室培養(yǎng)使其偏離原生境，甚至改變可能基因組合多聚酶鏈反應核酸雜交技術核酸多態(tài)性技術rRNA、rDNA序列分析基因芯片技術微生物醌指紋法多聚酶鏈反應（PCR）試驗原理：模擬天然DNA復制過程，在體外擴增特異性DNA片段基本要素：模板、引物、原料、DNA聚合酶應用：快速、靈敏、簡便、特異產物可用凝膠電泳定性定量，也可進行克隆、轉化或測序目前用于環(huán)境細菌、毒素、病毒及其他微生物的檢測多聚酶鏈反應（PCR）試驗方法模板DNA變性：90~95℃模板DNA分子與引物結合：45~72℃引物的延伸：72℃上述變性－復性－延伸稱為一個PCR循環(huán)，DNA擴增量呈指數上升實際反應中因引物量減少、原料及酶濃度改變、終產物反饋抑制等原因不能達到理論值多聚酶鏈反應（PCR）核酸雜交技術探針：是能與特定核苷酸序列互補、已經標記的DNA（或RNA