臨床免疫學(xué)檢驗：6 免疫酶技術(shù)

第八章酶免疫技術(shù)Enzymeimmunoassay，EIAP75概述：

70年代初在免疫熒光技術(shù)基礎(chǔ)上建立。

較IF、RIA(radioimmunoassay)更優(yōu)越,

具有敏感、安全、穩(wěn)定、易觀察結(jié)果等優(yōu)點原理：

利用酶標(biāo)記Ag或Ab后不改變Ag、Ab反應(yīng)特異性，同時又不影響酶的活性，結(jié)合在AgAb上的酶催化底物，生成有色產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物顏色深淺推測出待測物中相應(yīng)物質(zhì)（Ab、Ag)有無及含量多少。Ag+AbE

AgAbE+底物呈色反應(yīng)免疫酶技術(shù)具有

特異性—Ag、Ab反應(yīng)

敏感性—酶的高效催化作用常用的酶（一）選擇酶的要求1.自然界存在廣，易獲得2.易純化、性穩(wěn)、活力高3.形成的酶結(jié)合物穩(wěn)定，并保留酶、抗體或抗原的活性4.底物來源方便并易保存5.反應(yīng)后有色產(chǎn)物能快速測定6.酶分子量不能太大，太大不易進入組織細胞內(nèi)，影響組化染色定位（二）常用的酶辣根過氧化物酶堿性磷酸酶葡萄糖氧化酶等

辣根過氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP)一種鐵卟啉蛋白質(zhì)，分子量4.4萬，能進入細胞內(nèi)酶活性強，酶結(jié)合物可長期保存最適pH為5.5左右

選用時注意酶純度和活性純度：RZ表示，反映酶含量與蛋白含量之比，最好要RZ值為3.0左右活性：每1mg酶中所具有的活性單位，應(yīng)大于250u/mg

HRP的底物：鄰苯二胺(OPD),四甲基聯(lián)苯胺（TMB）反應(yīng)體系中作為供氫體DH2+H2O2

D+2H2O供氫體受氫體有色產(chǎn)物

HRPOPD特點：

有色產(chǎn)物為黃色

空白對照接近無色

敏感度高，有致癌作用TMB特點：有色產(chǎn)物為藍色

無致癌作用底物系統(tǒng)（包括供氫體、受氫體）

臨用時配，配后避光保存酶免疫技術(shù)分類:酶免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（免疫組化）---組織標(biāo)本中抗原的定位檢測酶免疫分析（酶聯(lián)免疫吸附實驗，Enzyme-Linkedimmunosorbent

assay,ELISA)---液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性、定量檢測酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-Linkedimmunosorbentassay）

ELISA

一.原理：

將酶分子與Ab或Ag連接成一酶結(jié)合物（酶標(biāo)記物），當(dāng)它與固相載體中相應(yīng)Ag或Ab相遇，形成酶標(biāo)記的AgAb復(fù)合物，加入底物，酶催化底物，生成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色深淺可測出溶液中Ag或Ab的量。固相載體聚苯乙烯Ag或Ab吸附到固相載體上的過程,稱為包被(酶免疫測定法)

實驗中所需酶標(biāo)抗體的制備方法同熒光抗體制備：純化后的抗體+酶透析去除游離酶測定酶標(biāo)抗體工作濃度試驗中有關(guān)術(shù)語及試劑：

包被(coat)：將Ag或Ab吸附在固相載體上的過程，又稱固相化或吸附。包被后，不能被洗脫。包被緩沖液：PH9.6CB

洗滌(wash)：PH7.2-7.4PBS

酶結(jié)合物

：酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原

終止液：2MH2SO4OPD：HRP催化后其有色產(chǎn)物為黃色，H2SO4終止后變?yōu)槌壬ㄗ厣?。TMB：HRP催化后其有色產(chǎn)物為藍色，H2SO4終止后變?yōu)辄S色二.方法類型和操作步驟（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法步驟：包被已知Ab

洗滌加待測標(biāo)本（測Ag？）洗滌加酶標(biāo)Ab

洗滌加底物加終止液觀察結(jié)果雙抗體夾心法的基本實驗過程洗滌三次終止液

該法主要用于檢測抗原包被的抗體與酶標(biāo)抗體屬同一種類抗體每檢測一種抗原就需制備相應(yīng)的酶標(biāo)抗體，較麻煩（二）間接法測抗體步驟：包被已知Ag＋待測標(biāo)本（測Ab？）

——反應(yīng)一段時間后，洗滌——加酶標(biāo)抗抗體（酶標(biāo)羊抗人IgG）——洗滌——加底物——加終止液，觀察結(jié)果。

該法主要用于測抗體酶標(biāo)記一種抗抗體可以用于多種抗體的檢測包被抗體加標(biāo)本（抗原）加抗體加酶標(biāo)抗抗體間接法測抗原（三）雙位點一步法步驟：包被抗體A＋待測標(biāo)本＋酶標(biāo)抗體B——洗滌，＋底物——終止液，觀察結(jié)果（檢測Ag，Ag至少含A、B兩個抗原表位）

該法是一次性加入標(biāo)本和酶標(biāo)抗體，試驗程序簡單，提高了檢測的特異性用于檢測Ag,且Ag是具有至少2種抗原表位的多價抗原反應(yīng)系統(tǒng)中固相Ab與酶標(biāo)Ab的量相對于待測Ag是過量的，因此復(fù)合物的形成量與待測Ag含量成正比（在方法可檢測范圍內(nèi)）（四）競爭法步驟：待測管：已知Ab包被＋待測標(biāo)本（Ag？）——洗滌，＋酶標(biāo)Ag——洗滌，＋底物——顯色先加先加（五）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

親和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四個亞基組成，每一亞基可以與一分子生物素結(jié)合

生物素(biotin)：維生素H，可與蛋白質(zhì)、糖類、酶類等結(jié)合，與親和素特異結(jié)合后極穩(wěn)定親和素生物素生物素生物素生物素

親和素—生物素在ELISA中使用：

三.ELISA結(jié)果的判定（一）肉眼判定

與陽性、陰性對照顏色比較：

結(jié)果判定2.若待檢孔顯色深于或等于陽性對照孔則判定為陽性；3.若待檢孔顯色介于陰性對照孔和陽性對照孔之間則判定為弱陽性。1.若待檢孔顯色淺于陰性對照則判定為陰性；（二）酶標(biāo)光度儀檢測A492值（吸光率）：比色法1.與陽性、陰性對照測定值比較2.P/N比值：大于2.0為陽性，小于2.0

為陰性

P:positive（待測吸光度值）

N:negative四.ELISA試驗的影響因素（一）固相載體

常用固相載體材料：聚苯乙烯。其特點為吸附Ag或Ab的能力強，一但吸附，不能被洗脫。

固相載體：酶標(biāo)板（微量反應(yīng)板，12×8；

可分軟、硬板

一次性使用，不可回收酶標(biāo)板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高板批間、孔間性能相近（二）抗原、抗體Ag：需純化Ab：需效價高、親和力強、純化（三）試驗條件1.包被（coating)：一般用pH9.6CB(carbonatebuffer)，0.05M,有利于蛋白質(zhì)吸附

包被濃度：0.1~100g/ml，一般常用10g/ml包被時間、溫度：4℃過夜或37℃1-3h包被量：100ul封閉(blocking)：用1%~5%牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清或脫脂牛奶緩沖液浸泡1~2小時2.抗原抗體反應(yīng)的條件（1）微堿性有利于抗原抗體結(jié)合，故用pH7.4PBS(phosphatebuffersaline)洗滌（2）去污劑有利于AgAb形成，洗液中加0.05%Tween-20（3）Ag、Ab反應(yīng)時間、溫度：一般37℃、30~40min3.洗滌

采用PH7.2-7.4PBS洗滌，規(guī)一化；每次浸泡1min，拍干，共洗滌3~4次或每次浸泡30s，共洗滌5次4.酶促反應(yīng)條件溫度37℃

時間10minpH5.5

底物量一致5.排除干擾：多設(shè)對照ELISA試驗應(yīng)設(shè)對照應(yīng)設(shè)對照

操作應(yīng)得結(jié)果陽性對照

同標(biāo)本一樣顏色深

陰性對照

同標(biāo)本一樣顏色淺or無色酶結(jié)合物對照

加酶步加入無色底物對照

加底物步加入無色空白對照

只加終止液無色（以間接法為例，每孔均已包被Ag）

血清100ul酶標(biāo)二抗100ul底物100ul終止液100ul待測待測標(biāo)本血清+++陽性陽性對照血清+++陰性陰性對照血清+++酶結(jié)合物對照

PBS100ul+++底物對照

PBS100ulPBS100ul++空白對照PBS100ulPBS100ul

PBS100ul+五.ELISA試驗優(yōu)缺點優(yōu)點:1.既可測抗原又可測抗體2.微量、定性、定量3.特異性、敏感性高4.操作簡單,可不用特殊儀器缺點:1.影響因素多,多方把關(guān)2.偶有假陽性、假陰性六.膜載體的酶免疫測定（P115）（一）斑點酶免疫吸附試驗Dot-ELISA特點:1.固相載體為硝酸纖維素膜2.酶促反應(yīng)后在膜上形成有色沉淀物固相Ag（二）免疫印跡試驗immunoblottingtest，IBT七.應(yīng)用(包括所有標(biāo)記技術(shù))(一)病原體的診斷及研究1.病毒、細菌等傳染病的診斷

(測抗原或抗體)2.病毒、細菌表面抗原的研究(二)某些疾病的診斷1.某些微量物質(zhì)有關(guān)疾病的診斷2.腫瘤的診斷及定位3.自身抗體檢測協(xié)助自身免疫病診斷4.寄生蟲疾病的診斷等(三)免疫學(xué)方面的研究

T、B細胞的發(fā)生、演化、表面抗原改變等的研究(四)微量物質(zhì)的檢測

體內(nèi):微量蛋白質(zhì)、激素、酶等抗原;藥物、糖等半抗原工農(nóng)業(yè):微生物、微量物質(zhì)等思考題：1.ELISA的原理、方法（以間接法測抗體和雙抗夾心法為例）及影響因素。2.ELISA試驗應(yīng)設(shè)哪些對照，為什么？3.判斷ELISA試驗結(jié)果的方法。第九章化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)P89

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，來檢測抗原、或抗體的方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析的類型一.化學(xué)發(fā)光酶免疫測定

試驗前部分與ELISA一樣，使用HRP或ALP來標(biāo)記已知的Ab(或Ag)，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的Ag(或Ab)反應(yīng)后，經(jīng)洗滌加入底物（發(fā)光劑），酶催化、分解底物發(fā)光，用儀器檢測發(fā)光強度，判斷結(jié)果。

如酶是HRP，常用底物是魯米諾或其衍生物。二.直接化學(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光劑（吖啶酯等）作為標(biāo)記物直接標(biāo)記抗原或抗體，從而檢測待測標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的免疫測定方法。第十一章膠體金免疫技術(shù)（P108）

膠體金又稱金溶膠，是金鹽(氯金酸）被還原（還原劑：檸檬酸鈉）成原子金后形成的金顆粒懸液膠體金的特性：1.膠體金性質(zhì)：顆粒穩(wěn)定均勻，分散懸浮，1~100nm2.呈色性：顏色與顆粒大小有關(guān)

2~5nm